研究目的:慢性堵塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)是一种无法治愈的、渐进性的肺部疾病,这表现在大气道(慢性气管炎),小气道和肺泡(肺气肿)。暴露于香烟烟雾是罹患COPD的主要危险因素。慢性支气管炎与慢性炎性细胞浸润以及过度的气道粘液分泌有关。对于吸烟者和COPD患者而言,这种过剩的粘液分泌是产生咳嗽和呼吸困难等症状的重要原因。粘液由在大气道中的杯状细胞产生,而长期暴露于香烟烟雾会导致杯状细胞数量增加,粘液分泌增多。在上皮细胞中存在若干信号通路与促进杯状细胞分化及粘液产生有关。格罗宁根哮喘和COPD研究中心对吸烟者的研究表明,无肺部疾病的吸烟者及患有COPD同时伴有咳嗽和过多粘液分泌症状的吸烟者体内,多种基因在其上皮细胞中具有较高的表达水平。其中一个很重要的基因是SPDEF,该基因是这整个调控网络中的关键基因。已有研究结果表明,SPDEF可以促进杯状细胞的分化以及粘液的产生。SPDEF蛋白的表达可以被表观遗传学机制调控,“开启”或“关闭”该基因的表达。本论文的研究总体目标主要包括以下几方面:1)研究与COPD患者肺组织中粘液细胞数量增加和粘液过度分泌相关的表观遗传学变化;2)通过改变病人的表观遗传学特征(“表观遗传学编辑”),以减少COPD患者肺组织中粘液的产生与分泌。研究方法:本课题分为两个部分展开研究。第一部分:(1)通过从COPD患者和对照组的气道中分别分离原代上皮细胞,利用气液界面(Air-Liquid interface,ALI)培养模式建立体外杯状细胞和纤毛上皮细胞分化模型,并且添加白介素13(IL-13)可以促进杯状细胞的分化;(2)在培养过程中利用Realtime PCR监测与粘液分泌相关的基因的表达:转录因子SPDEF和FOXA2,粘液的主要成分之一粘蛋白MUC5AC,粘蛋白包装所需的潜在分子伴侣AGR2;(3)利用焦磷酸化测序检测转录因子SPDEF和FOXA2基因转录起始区域的DNA的甲基化,分析杯状细胞的分化是否伴随着SPDEF和FOXA2基因的DNA甲基化的变化;(4)在没有添加IL-13的培养系统中,比较分析了来源于COPD个体和对照组个体的上皮细胞分化至第14天时相关基因的表达水平和甲基化水平,分析COPD患者肺组织中杯状细胞数量增加和粘液过度分泌与SPDEF和FOXA2基因的DNA甲基化的调控的相关性。第二部分:(1)通过比较在不同人肺细胞系中SPDEF和MUC5AC基因的表达,以及SPDEF基因的DNA的甲基化,选择在与COPD原代细胞具有类似的SPDEF和MUC5AC基因的高表达的A549人肺细胞系中开展相关的研究工作;(2)设计可以特异性识别SPDEF启动子区域的锌指结构或引导RNA,利用锌指结构或CRISPR/d Cas9系统,与抑制因子(KRAB,DNA/组蛋白甲基化转移酶)的协同作用,实现对SPDEF基因表达的表观调控(表观编辑);(3)通过对SPDEF基因表达的负调节,进而实现下游通路中和粘液有关的MUC5AC和AGR2等基因的负调控;(4)通过对多个不相关基因表达的检测,研究靶向SPDEF基因的表观编辑的特异性;(5)通过多次细胞传代,研究表观编辑对SPDEF基因表达调控的长期稳定性。结果:第一部分:(1)在添加有白介素13(IL-13)的对照组上皮细胞的分化过程中,伴随着与黏液产生相关的基因如MUC5AC,AGR2和SPDEF表达的增加,以及与抑制黏液产生有关的基因FOXA2的表达水平的降低;(2)在分化过程中SPDEF基因表达的增加与SPDEF的DNA甲基化的改变之间存在正相关关系;(3)与对照组相比,来自COPD个体的上皮细胞中SPDEF和MUC5AC基因具有较高的表达水平,并且与SPDEF基因的较低的DNA甲基化水平有关。第二部分:(1)所有靶向SPDEF的抑制性融合蛋白都能有效的抑制SPDEF信使RNA和蛋白的表达,并且伴随有和粘液有关的MUC5AC和AGR2等基因的负调控;(2)有别于G9A的酶活性突变体或其他融合蛋白,组蛋白甲基化转移酶G9A的对SPDEF的抑制作用不受细胞有丝分裂的影响,具有一定的稳定性。结论:(1)我们发现在来自COPD患者的气道上皮细胞中,SPDEF基因的DNA甲基化水平和表达水平都发生了改变,我们推测SPDEF基因可能在COPD的发病机制中起着十分重要的作用,因此该基因可能是一个未来用于表观遗传学编辑和治疗COPD的良好靶标。(2)由细胞系的初步研究结果表明,有针对性的增加SPDEF基因的DNA/组蛋白甲基化确实可抑制SPDEF基因的表达和粘液的产生。这些极具发展前景的研究成果是通过改变表观遗传学实现COPD治疗迈开的第一步,为调节任意靶基因的表达开辟了广阔的前景。