在过去的几十年中,虽然肿瘤的诊断和治疗取得了巨大的进展,但若想彻底攻克肿瘤,仍需要我们对肿瘤的发生发展具有更进一步的理解。近来的研究表明,和普通干细胞在生物学特性上有较大相似性的肿瘤干细胞在肿瘤的发生发展过程中起着至关重要的作用。因而,根据普通干细胞的生物学机制探索针对肿瘤干细胞的靶向治疗能够为治愈肿瘤提供希望。食管癌是世界上最为常见的六大恶性肿瘤之一。全世界每年新发食管癌病例可达48万人,约有25万发生在中国,是危害包括我国在内的许多发展中国家的主要恶性肿瘤之一。我国食管癌的常见类型是食管鳞癌,其侵袭性强,进展迅速且易耐药及复发。传统的肿瘤治疗能使瘤体缩小,甚至消失,却不能防止肿瘤复发,说明在肿瘤组织中有一小撮肿瘤细胞能够逃避药物杀伤,提示肿瘤干细胞的存在。肿瘤干细胞是指肿瘤组织中极少数具有干细胞特性的细胞,它们具有自我更新及分化潜能,是肿瘤生长、转移和复发的源泉。目前已在多种组织和器官的肿瘤中证实了肿瘤干细胞的存在。但是,关于食管癌干细胞的研究仍处于探索阶段,并未发现明确的食管癌干细胞标志。干细胞转录调控因子,如OCT4、SOX2、HIWI等,调节胚胎及组织的发育,参与胚胎干细胞和原始生殖细胞的自我更新,是维持细胞全能性所必需的转录因子,而在分化或成熟的组织中其表达水平降低或消失。肿瘤细胞,尤其是低分化肿瘤组织中的细胞,在细胞表型和生物学特性上与干细胞有很多相似的地方,其中主要的一条就是干细胞和肿瘤细胞都具有自我更新和分化增殖的能力。越来越多的研究表明OCT4、SOX2以及HIWI在肿瘤组织中也有表达。目前已证实的有乳腺癌、生殖细胞瘤、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、软组织肉瘤以及肺癌等,预示其对肿瘤的发生发展也具有重要意义。OCT4是第一个被发现只在全能和多能细胞中表达的转录因子,不但参与胚胎干细胞和原始生殖细胞的自我更新,维持细胞全能性,还能直接控制胚胎干细胞的分化方向。同时,其还能通过OCT4/TCL1/AKT1信号转导通路抑制胚胎干细胞凋亡,维持其增殖潜能。OCT4在肿瘤的发生发展中也起着关键作用。OCT4在上皮组织中持续高表达会抑制细胞分化,从而导致上皮发育异常。将oct4基因导入Swiss 3T3细胞后,可以使部分细胞恶性转化,并且在随后的裸鼠移植实验中能够形成肿瘤。而且,OCT4的高表达能提高肿瘤的恶性程度,而OCT4的失活能使肿瘤的恶性程度得到抑制,说明其还具有癌基因的作用,表达异常可能会导致正常细胞的恶性转化,并且其表达水平与肿瘤细胞的恶性程度有关。OCT4、SOX2以及HIWI在食管鳞癌中的表达情况以及OCT4在食管鳞癌的发生发展中所起的作用,国内外尚未见报道。本研究通过检测OCT4、SOX2和HIWI在食管鳞癌细胞系和鳞癌组织中的表达情况,分析其表达与临床病理及预后的关系,为食管癌的早期诊断和预后提供理论依据。并且,本研究通过上调和下调OCT4在食管鳞癌细胞系KYSE70中的表达水平,探讨其在食管鳞癌发生发展过程中所起的作用。本研究共分以下三个部分:第一部分干细胞转录调控因子OCT4、SOX2和HIWI在食管鳞癌中的表达及其与临床预后的关系方法1.采用免疫细胞化学、real-time PCR、western-blot的方法检测OCT4、SOX2和HIWI在食管鳞癌细胞系KYSE70、KYSE140、KYSE450中的表达情况;2.采用免疫组织化学法检测OCT4、SOX2和HIWI在153例食管鳞癌组织以及10例正常食管上皮中的表达情况;3.结合OCT4、SOX2和HIWI在食管鳞癌组织中的表达情况以及患者10年随访资料,分析其表达与临床病理及预后的关系;4.统计学分析:应用SPSS16.0软件包分析数据。两个有序变量之间的联系用Spearman相关分析(exact version);分类变量之间的比较用Pearson’sχ~2检验;Kaplan-Meier法做生存分析,并用log-rank检验比较组间差异(两组间比较用Pooled over strata,三组间两两比较用Pairwise over strata);COX比例危险相关模型校对临床病理因素(年龄、性别、肿瘤位置、瘤体大小、淋巴结转移、组织学分级、侵润深度)进行多变量比较,确定和总生存期相关的独立危险因素。所有检验均为双侧检验,以α=0.05为检验标准。结果1.免疫细胞化学、real-time PCR、western-blot结果均显示,OCT4、SOX2和HIWI在食管鳞癌细胞系KYSE70、KYSE140、KYSE450中均有不同程度的表达;2.免疫组织化学结果显示,OCT4只在胞核中表达。153例食管癌标本中,105(68.7%)例为阴性或弱阳性,归为弱表达组;21(13.7%)例为中等阳性,归为中等表达组;27(17.6%)例为强阳性,归为强表达组;3.SOX2也为胞核着色。98(64.1%)例为阴性或弱阳性,归为弱表达组;36(23.5%)例为中等阳性,归为中等表达组；19(12.4%)例为强阳性,归为强表达组;4.HIWI为胞浆胞核均有着色。67(43.8%)例胞浆为阴性或弱阳性,86(56.2%)例胞浆为强阳性;104(68.0%)例胞核为阴性或弱阳性;49(32.0%)例胞核为强阳性。总的来说,46(30.1%)例胞浆胞核均为阴性或弱阳性,归为弱表达组;58(37.9%)例仅胞浆为强阳性,21(13.7%)例仅胞核为强阳性,共79(51.6%)例归为中等表达组;28(18.3%)例胞浆胞核均为强阳性,归为强表达组;5.Crosstabs分析显示,OCT4与SOX2在食管鳞癌中的表达水平呈正相关(P＜0.001,χ~2=58.248),而OCT4和HIWI(P=0.515,χ~2=3.263),SOX2和HIWI(P=0.642,χ~2=2.513)在食管鳞癌中的表达水平未见相关性;6.OCT4的表达水平与食管鳞癌的组织学分级(P＜0.001,χ~2=26.706)呈正相关;7.Kaplan-Meier生存分析显示,OCT4低表达组的肿瘤患者的总生存期明显长于中等表达组(P=0.002,χ~2=9.462),而中等表达组的生存情况又明显优于高表达组(P=0.023,χ~2=5.161);8.SOX2的表达水平与食管鳞癌的组织学分级(P＜0.001,χ~2=23.058)呈正相关;9.Kaplan-Meier生存分析显示,SOX2低表达组的肿瘤患者的总生存期明显长于中等表达组(P=0.018,χ~2=5.579),而中等表达组的生存情况又明显优于高表达组(P=0.01,χ~2=6.632);10.HIWI在食管鳞癌细胞胞浆的表达水平与肿瘤的侵润深度(P=0.035,χ~2=8.589)和组织学分级(P=0.011,χ~2=9.075)呈正相关;11.Kaplan-Meier生存分析显示,肿瘤细胞胞浆高表达HIWI的患者的总生存情况明显差于胞浆低表达HIWI的患者(P＜0.001,χ~2=17.05);12.HIWI在胞核的表达与临床病理学指标和患者的生存期均无相关性;13.OCT4、SOX2和胞浆中HIWI的表达水平都是影响食管鳞癌预后的独立因素,其相对风险度分别为2.625(P＜0.001)、1.976(P=0.028)和2.247(P=0.001)。第二部分食管鳞癌细胞系中干细胞样肿瘤细胞的分离及鉴定方法1.分别用Hoechest33342排斥法、Aldefluor试验及标记滞留法分离食管鳞癌细胞系KYSE70、KYSE140和KYSE450中干细胞样肿瘤细胞;2.检测干细胞样肿瘤细胞自我更新及分化能力;3.平板克隆形成实验检测干细胞样肿瘤细胞增殖形成克隆的能力;4. Real-time PCR检测干细胞相关因子oct4、sox2、nanog、hiwi、shh、gli1、snai1、twist1、tgf-β1和肿瘤相关因子bcl2、N-cadherin、E-cadherin、egfr、mmp2、mmp9、abcg2、abcb1在干细胞样肿瘤细胞中的表达；5. MTT法检测干细胞样肿瘤细胞对化疗药物5-Fu的敏感性:6.统计学分析:应用SPSS16.0软件包分析数据。统计学数据用均数士标准差((?)±s)表示,两样本均数比较采用独立样本t检验,多个样本均数比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验标准。结果1.利用Hoechest33342排斥法成功从KYSE70中分离出了SP细胞(0.9±0.17%),而未从KYSE140和KYSE450中分离出SP细胞;2. KYSE70、KYSE140和KYSE450中均未发现Alde~+细胞;3.利用标记滞留法成功从KYSE70和KYSE450中分离出了慢周期细胞,其比例分别为1.1±0.22%和0.4±0.08%,而未从KYSE140中分离出慢周期细胞;4. SP细胞经常规培养5代后,能分化出MP细胞,而MP细胞未能分化出SP细胞;5.平板克隆形成实验显示KYSE70 SP细胞的克隆形成率为55.33±5.03%;而相应MP细胞的克隆形成率为26.00±1.45%,两者比较差异具有显著性(P=0.001,F=2.704);6. KYSE70慢周期细胞的克隆形成率为45.89±2.52%;而相应快周期细胞的克隆形成率为18.89±1.02%,两者比较差异具有显著性(P＜0.001,F=4.129);7.与MP细胞相比,SP细胞中gli1、oct4、sox2、nanog、mmp2、mmp9、shh、abcg2、bcl2、N-cadherin、eefr、hiwi、twist1和abcb1的表达水平显著升高;8.与快周期细胞相比,慢周期细胞中gli1、oct4、nanog、mmp2、mmp9、snai1、tgf-β1、abcg2、bcl2、N-cadherin、egfr、sox2、hiwi、shh、twist1和abcb1的表达水平显著升高;9. 5-Fu对于KYSE70 SP细胞48h的IC50为22.55μg/ml,95%可信区间为19.63～25.77μg/ml;而对于MP细胞48h的IC50为11.91μg/ml,95%可信区间为10.02～13.85μg/ml;10. 5-Fu对于KYSE70慢周期细胞48h的IC50为22.22μg/ml,95%可信区间为19.22～25.52μg/ml;而对于快周期细胞48h的IC50为12.79μg/ml,95%可信区间为10.84～14.79μg/ml。第三部分上调及下调OCT4表达对食管鳞癌细胞生物学行为的影响方法1.将市售的oct4 cDNA克隆至真核表达载体pIRESpuro2;2.用真核表达重组子pIRESpuro2-OCT4稳定转染食管鳞癌细胞系KYSE70。Real-time PCR及western-blot检测被转染细胞OCT4的表达情况,并将其命名为KYSE70-OCT4,同时将空质粒转染组命名为KYSE70-pIRESpuro2;3.将市售的OCT4 RNAi质粒pLKO.1-OCT4-shRNA稳定转染食管鳞癌细胞系KYSE70。Real-time PCR及western-blot检测被转染细胞OCT4的表达情况,并将其命名为KYSE70-OCT4-shRNA;4.Real-time PCR检测OCT4对于干细胞相关因子sox2、nanog、hiwi、shh、gli1、snai1、twist1、tgf-β1和肿瘤相关因子bcl2、N-cadherin、E-cadherin、egfr、mmp2、mmp9、abcg2、abcb1表达水平的影响;5.平板克隆形成实验检测OCT4对食管鳞癌细胞系KYSE70克隆形成能力的影响;6.MTT法检测OCT4对KYSE70抗化疗药物5-Fu的影响;7.Annexin V-FITC/PI双染法检测OCT4对KYSE70凋亡的影响;8.分别将KYSE70-OCT4、KYSE70-pIRESpuro2和KYSE70-OCT4-shRNA接种于裸鼠右前肢北侧皮下,每只2×10~6个,每组5只。连续观察5w,记录裸鼠皮下成瘤大小;9.统计学分析:应用SPSS16.0软件包分析数据。统计学数据用均数±标准差((?)±s)表示,两样本均数比较采用独立样本t检验,多个样本均数比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验标准。结果1.成功构建OCT4真核表达重组子pIRESpuro2-OCT4,稳定转染KYSE70后使其OCT4表达水平为空质粒转染组的7.43倍;2.将市售OCT4 RNAi质粒pLKO.1-OCT4-shRNA稳定转染KYSE70后使其OCT4表达水平下降71%;3.将pIRESpuro2-OCT4转染KYSE70细胞后,细胞形态明显变小,变圆,且不再单层生长,而呈立体生长,并能在超低黏附培养板中克隆生长,形成细胞球;4. OCT4上调引起表达上调的基因有sox2,5.51倍;nanog,19.26倍;mmp9,13.17倍;snai1,13.06倍;abcg2,3.76倍;gli1,1.38倍;egfr,2.53倍;romp2,1.33倍;twist1,2.31倍;bcl2,1.63倍;shh,1.58倍;tgf-β1,,2.04倍;abcb1,1.85倍;而E-cadherin表达下调36%;5. OCT4下调引起表达下调的基因有sox2,0.73倍;nanog,0.14倍;mmp9,0.48倍;N-cadherin,0.35倍;snai1,0.33倍;abcg2,0.66倍;gli1,0.75倍;mmp2,0.61倍;twist1,0.75倍;bcl2,0.54倍;tgf-β1,0.56倍;6.KYSE70-pIRESpuro2的克隆形成率为15.22±2.14%;KYSE70-OCT4-shRNA的克隆形成率为9.11±2.01%;而KYSE70-OCT4的克隆形成率为40.00±2.52%。3组组间比较差异具有显著性(P＜0.001,F=160.938);7.5-Fu对于KYSE70-OCT4 48h的IC50为18.89μg/ml,95%可信区间为16.00～21.99μg/ml;对于KYSE70-pIRESpuro2 48h的IC50为9.30μg/ml,95%可信区间为7.44～11.14μg/ml;对于KYSE70-OCT4-shRNA48h的IC50为5.88μg/ml,95%可信区间为4.31-7.38μg/ml;8.KYSE70-OCT4的凋亡率为3.02±0.75%,KYSE70-pIRESpuro2的凋亡率为3.97±1.03%,而KYSE70-OCT4-shRNA的凋亡率为25.63±3.57%。方差分析结果显示KYSE70-OCT4-shRNA的凋亡率比KYSE70-OCT4和KYSE70-pIRESpuro2显著升高(P＜0.001),而KYSE70-OCT4与KYSE70-pIRESpuro2相比差异没有显著性(P=0.898);9.KYSE70-OCT4接种组在接种后第7d开始可观察到皮下小结节,在第14d、21d、28d和35d瘤体大小分别为69.8±10.3mm~3、415.4±109.3mm~3、973.4±127.1mm~3和1713.4±225.1mm~3;KYSE70-pIRESpuro2接种组第10d开始可观察到皮下小结节,相应时间点瘤体大小分别为46.6±11.1mm~3、203.4±37.9mm~3、532.6±100.4mm~3和1023.2±149.5mm~3;而KYSE70-OCT4-shRNA接种组第11d才出现皮下小结节,相应时间点瘤体大小分别为41.4±6.19mm~3、122.8±20.1mm~3、259.4±35.9mm~3和638.4±63.5mm~3。从第21d起,3组肿瘤体积大小差异具有显著性(P＜0.001)。结论1.首次检测到干细胞因子OCT4、SOX2和HIWI在食管鳞癌细胞系和食管鳞癌组织中均有不同程度的表达；2.OCT4与SOX2在食管鳞癌中的表达水平呈正相关,而OCT4和HIWI,SOX2和HIWI在食管鳞癌中的表达水平未见相关性;3.OCT4和SOX2在食管鳞癌中的表达水平均与肿瘤的组织学分级以及患者的总生存期相关;4.HIWI在食管鳞癌细胞胞浆中的表达水平与肿瘤的侵润深度、组织学分级以及患者的总生存期相关;5.OCT4、SOX2和胞浆中HIWI的表达水平都是影响食管鳞癌预后的独立因素;6.食管鳞癌细胞系中存在干细胞样肿瘤细胞,其自我更新能力、克隆形成能力以及耐药性都显著高于普通肿瘤细胞;7.一些干细胞及肿瘤相关因子在食管鳞癌干细胞样肿瘤细胞中的表达水平明显高于普通肿瘤细胞;8.OCT4的表达水平直接影响食管鳞癌细胞的细胞形态、生长方式、耐药性、克隆形成能力、凋亡率以及致瘤能力,预示其在食管鳞癌的发生发展过程中具有重要作用。