背景:蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是三大脑血管疾病之一,致死率、致残率高,危害极大。SAH后蛛网膜下腔中常常留有大量红细胞及其裂解产物,这些物质可触发一系列复杂的病理生理改变,包括脑水肿、氧化应激、炎性反应、细胞毒性作用等。而且,这些改变相互交错、一起作用,最终导致神经细胞损伤、神经功能障碍。Peroxiredoxin蛋白家族(peroxiredoxins,Prxs)是一类真核细胞中普遍存在的、起清除细胞内过氧化物作用的抗氧化剂,同时介导调控过氧化氢水平的信号通路,并参与许多疾病的发生发展。进一步研究发现,Prxs出胞后失去原有的细胞保护功能,所扮演的角色转变。例如,当脑缺血卒中发生后,Prxs释放至细胞外,启动严重的炎性反应,作用机制可能为通过Toll样受体2(toll-like receptor 2,TLR2)与Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)、激活核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)途径启动损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMP)型炎性反应,导致神经细胞损伤加剧,同时伴随Prxs的进一步释放,促炎作用级联放大,最终出现严重的损伤结果。胞外的Prxs表达水平也会相应升高。而Peroxiredoxin 2(Prx2)作为Prxs家族六个成员之一,在红细胞中蛋白含量居第三(仅次于血红蛋白),在神经元中也有广泛表达。由于Prx2这一独有的细胞分布特点,其在SAH后EBI中可能会扮演极其重要的作用。理由是:红细胞及其裂解产物是SAH后EBI的重要致伤因素,激活诸多损伤通路,而神经元恰恰是这些损伤通路最终的靶细胞,因果交错,作用叠加。因此,我们提出假设:当SAH发生后,蛛网膜下腔中红细胞会因衰老或肿胀等因素逐渐破裂、释放出Prx2;脑组织中神经元因缺血、炎性反应等因素出现损伤、坏死也会释放出Prx2,导致脑脊液、脑皮层间质中Prx2(即胞外Prx2)表达异常升高。-2-这些胞外prx2除了可能会直接导致神经细胞损伤外,还可能会启动、并介导damp型炎性反应,加剧神经元进一步损伤,并伴随prx2进一步释放,作用级联放大,最终在sah后早期脑损伤中扮演极其重要的角色。方法:本课题首先运用western-blotting技术观察prx2在红细胞中表达情况,再运用免疫荧光技术分别从体内、体外观察prx2在各种脑细胞中分布,验证脑组织中prx2是否仅在神经元上表达。随后,采用兔枕大池一次注血方法建立大动物实验性蛛网膜下腔出血模型,用western-blotting、酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)技术检测红细胞裂解液组与红细胞悬液组、对照组中脑组织中prx2与脑脊液(cerebrospinalfluid,csf)中prx2、炎性因子(il-6、tnf-α)的含量,用免疫组织化学、nissl染色、he染色等技术观察早期脑损伤及基底动脉痉挛情况,初步得出胞外prx2可能参与早期脑损伤作用中。其次,分别建立sah体内及体外模型,运用western-blotting、real-timepcr等技术观察sah后组织、原代神经元及培养基中prx2在各个时程表达水平的变化,以验证sah后神经元中prx2表达水平是否上升及被释放至胞外。然后,运用western-blotting、elisa及细胞活性检测(cck8)等技术对胞外prx2对小胶质细胞(bv2)的激活(tlr4、myd88及nf-κb表达上调)、炎性因子白介素6(interleukin-6,il-6)、肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)的释放及对原代神经元的损伤等作用进一步研究,阐述胞外prx2在实验性sah后早期脑损伤的作用机制。最后,回归临床,收集行髋关节置换术及sah患者的csf,将csf浓缩50倍后用于western-blotting观察prx2的表达,然后分析csf中prx2水平与hunt-hess分级的关系。结果:体内及体外实验结果均表明:prx2在脑组织中仅神经元广泛表达,并在红细胞中含量丰富。sah后蛛网膜下腔中的红细胞裂解、其胞内prx2将进入csf中,而神经元中Prx2的m RNA水平早期迅速上调、蛋白表达随后也明显上升,随着神经元损伤、死亡、其胞内Prx2也被释放进入培养基中,这两者为胞外Prx2的来源。兔枕大池注射红细胞裂解液实验显示胞外Prx2表达与炎性因子含量正相关,并可能参与早期脑损伤作用中。随后进一步研究发现,胞外Prx2既可以直接促进神经元死亡、凋亡外,也可以通过激活TLR4/NF-κB通路、促进炎性因子释放,明显加剧神经元损伤,后者作用更为明显。最后,临床实验表明SAH后第3天患者CSF中Prx2含量升高,并与Hunt-Hess分级呈正相关。结论:本课题通过体内、体外实验再次证实:Prx2在脑组织中仅神经元广泛表达,并在红细胞中含量丰富。SAH后胞外Prx2含量上升,除直接促进神经元死亡外,更为重要的是通过激活TLR4/NF-κB通路、促进炎性因子释放,进一步加剧神经元损伤。在临床上,CSF中Prx2含量也可作为SAH患者病情判断及预后分析的可靠标志物。本课题的发现对SAH后早期脑损伤的复杂机制做了进一步地补充、完善,同样也提示通过干预蛛网膜下腔中红细胞的裂解及胞外Prx2信号通路可能会提高SAH患者的治疗效果。