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p-葡聚糖酶是一类广泛存在于植物和微生物体内的水解酶,它能水解p-葡聚糖中的p-1,3和p-1,4-糖苷键,产生寡糖和还原单糖。p-葡聚糖酶在酿造业、饲料工业、制糖工业、造纸工业等领域有着广泛的应用。本研究主要对一株里氏木霉的β-葡聚糖酶基因(EG)进行克隆和表达,并比较研究了重组p-葡聚糖酶(EG)及其A35V突变株(MEG)的理化性质。根据NCBI GeneBank数据库中登录号为EU149644的基因序列信息,设计相关引物,用重叠延伸PCR法从里氏木霉基因组中克隆到一条长为657bp的EG编码基因。本文首先构建了pET-32a-eg重组质粒在大肠杆菌中进行表达,结果表明其在大肠杆菌中的重组蛋白大多数形成不表现活性的包涵体。大肠杆菌系统显然不适于重组EG的表达,本文采用毕赤酵母系统作为研究重组EG的表达系统。本文构建了pPIC9K-eg和pPIC9K-muteg (A35V)重组质粒,获得了重组EG和MEG (A35V)的表达菌株GS115；对构建的毕赤酵母工程菌株GS115-pPIC9K-eg的产酶条件进行优化,结果表明：菌株在初始pH为6.0的BMMY培养基中,初始诱导OD600为2.0,甲醇诱导浓度为2.0%,在30-C下发酵192h后酶活达到最高值47.738U/ml；经过盐析、脱盐、离子交换层析、疏水层析几个步骤的操作,对重组EG进行分离纯化,得到了回收率为62.46%、比活为1194.22U/mg的糖基化EG；用内切糖苷酶Endo Hf对重组EG进行处理,结果揭示重组EG包含糖基化和非糖基化两种形式,且糖基化EG占较大比例；糖基化EG的最适温度为60℃,最适pH为6.0；与糖基化EG相比,MEG最适温度、最适pH和pH稳定性没有改变,但酶的温度稳定性有一定程度的提高：MEG在60℃中处理时,酶失活的程度相对于糖基化EG低,甚至在70℃下处理10min,仍然能保持较高酶活,但在70℃中处理更长时间或者在更高温度下处理,酶活迅速损失。本文成功克隆了里氏木霉来源的β-葡聚糖酶基因,成功分离纯化获得糖基化的β-葡聚糖酶,对该酶及突变株的理化性质进行一定研究。本研究对促进EG的工业化生产具有重要的意义,对毕赤酵母发酵表达EG、重组EG分离纯化及EG的工业应用是很好理论的指导。