一、研究背景： 骨肉瘤是骨科领域里最常见的恶性骨肿瘤，近二十年来实施的手术联合大剂量化疗，使骨肉瘤手术后五年生存率提高到60-70﹪。由于化疗药物的剂量大、毒副作用大、费用高，尤其是仍有40-50﹪的骨肉瘤患者对现行的化疗方案不敏感以及骨肉瘤的耐药性已经成为进一步提高骨肉瘤患者生存率的瓶颈。目前国际上现行的化疗方案已经很难在骨肉瘤治疗及患者远期生存率方面有突破性的进展。 传统中药源自天然，具有长期的临床应用基础，其毒副作用小，治疗有效，作用机理有别于化学合成药物，开发风险也相对较低，展现出巨大的开发潜力和产业发展前景，己成为新药开发和世界医药产业的重要发展方向之一。近年来，中药对恶性肿瘤的杀瘤、抑瘤作用已引起国内外医学界广泛的关注，也是抗癌药物研发的一个有效途径。我们在骨肉瘤的综合治疗程式中，寻找有中国特色的、有效的抗骨肉瘤中药，研究中药及其提取物对骨肉瘤的作用可能为骨肉瘤的治疗开辟一条新的途径。 二、研究目的： 1.建立中药单体对骨肉瘤细胞系作用的中药筛选研究模型。 2.深入开展新有效中药对骨肉瘤作用机制的研究，并与传统化疗药物对照，为临床应用提供实验依据。 3.为开发和制取新的对骨肉瘤特异作用的中药创造条件，以进一步开展临床前期研究。 三、研究内容： 1.筛选出具有明显抑制骨肉瘤细胞增殖的中药单体选取蟾毒灵，华蟾酥毒基，酯蟾毒配基，高三尖杉酯碱，奇果菌素，冬凌草甲素，槲皮素，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，汉黄芩素，黄芩素，野黄芩苷，黄芩苷，柚皮素丁二酸酯，槲皮苷，异槲皮苷和柚皮素，共16种中药单体，DMSO溶解后，分别取不同浓度梯度，作用骨肉瘤U-20S及U-20S/MTX<300>(氨甲喋呤耐药细胞株)，72小时后，MTT法测定它们对骨肉瘤细胞株的半数有效抑制剂量(IC50)，选用化疗药物氨甲喋呤(MTX)作对照。 2.蟾毒灵等中药单体诱导骨肉瘤细胞凋亡及对细胞周期的影响实验设中药单体处理组和空白对照组，利用下列方法来检测蟾毒灵等中药单体诱导骨肉瘤细胞凋亡及对细胞周期的影响：①细胞形态学及Hoechst 33258细胞核染色，观察中药单体诱导骨肉瘤细胞凋亡的细胞形态学变化；②流式细胞仪技术及Annexin V/PI双标染色，分析细胞凋亡率及细胞周期；③DNA琼脂糖凝胶电泳，观察细胞DNA降解梯形条带的电泳图改变。 3.探讨蟾毒灵诱导骨肉瘤细胞凋亡作用的分子机制Westem blotting法检测各组细胞的P53、Bax、Bcl-2和caspase-3凋亡相关蛋白的表达。 4.探讨蟾毒灵对骨肉瘤氨甲喋呤敏感及耐药细胞株的二氢叶酸还原酶(DHFR)表达的影响利用RT-PCR及Westem blotting法，检测蟾毒灵处理的U-20S及U-20S/MTX<300>两株细胞DHFR的mRNA转录水平和蛋白的改变，探讨蟾毒类单体是否对DHFR的表达有影响。 四、研究结果： 1.选取骨肉瘤细胞系，体外培养骨肉瘤细胞为药物实验模型，用MTT法及细胞形态学观察，在细胞水平检测了16种中药单体的体外抗骨肉瘤作用，发现存在肿瘤抑制作用的(根据IC50值及细胞形态学改变)有13种；其中能够以较低浓度抑制骨肉瘤细胞生长及增殖的中药单体有10种，对骨肉瘤U-20S及U-20S/MTX<300>(氨甲喋呤耐药细胞株)的IC50值分别为： 2.蟾毒灵等中药单体对骨肉瘤细胞株进行处理后，检测其诱导骨肉瘤细胞凋亡及对细胞周期的影响，发现①在形态学上，部分细胞变圆，变圆细胞呈体积缩小，折光性增强。随着药物浓度增大和作用时间的延长，变圆细胞逐渐增多，细胞表面逐渐凸起小膜泡(即凋亡小体)，部分细胞脱壁并见坏死细胞及碎片。而对照组细胞生长活跃，核分裂像多见，细胞异型性明显。Hoechst 33258染色可见细胞核染色质出现浓缩状态，凝集成块的凋亡改变，染色有核裂解、固缩、深染的凋亡细胞出现；②流式细胞仪发现蟾毒灵对骨肉瘤细胞株具有促进凋亡的作用，且凋亡率随着浓度的增加而增加，与对照组相比具有明显的差异性(P<0.01)，提示蟾毒灵诱导细胞凋亡存在一定的浓度依赖性；蟾毒灵处理后的细胞，G0/G1期细胞比例减少，G2/M期细胞比例增加，表明蟾毒灵是通过将细胞阻止在G2/M期来抑制肿瘤细胞的增殖。③DNA琼脂糖凝胶电泳：10-100ng/ml浓度的蟾毒灵处理48时后，骨肉瘤细胞的DNA电泳出现凋亡的特征性“梯状”条带。 3.为了探讨蟾毒灵诱导骨肉瘤细胞凋亡作用的分子机制，利用Western blotting检测凋亡相关蛋白p53，caspase-3，Bax及Bcl-2的表达：蟾毒灵(10-100ng/ml)处理骨肉瘤细胞株48小时后，Bcl-2蛋白的表达随浓度增加而降低，而p53，Bax的表达随浓度增加而升高，caspase-3出现明显活化；Bax/Bcl的比率也随着药物随着浓度的增加而升高。提示蟾毒灵诱导骨肉瘤细胞凋亡是通过影响上述凋亡相关蛋白的表达而作用的。 4.利用RT-PCR及Western blotting法，检测蟾毒灵处理的细胞DHFR的mRNA转录水平和蛋白水平的改变，结果发现蟾毒灵处理后，细胞的DHFR在mRNA转录水平和蛋白水平均无明显变化。提示蟾毒灵作用效果不受高表达DHFR影响的同时，也不影响骨肉瘤U-20S及U-20S/MTX<300>的DHFR的表达。 五、研究结论： 1.通过对16种中药单体的筛选，能明显抑制骨肉瘤细胞生长及增殖的中药单体有：蟾毒灵，高三尖杉酯碱，华蟾酥毒基，酯蟾毒配基，槲皮素，奇果菌素，冬凌草甲素，EGCG，汉黄芩素和黄芩素。 2.蟾毒灵体外能显著抑制人骨肉瘤细胞U-20S及U-20S/MTX<300>的生长并能诱导细胞凋亡，诱导肿瘤细胞凋亡可能为蟾毒灵主要的抗肿瘤机理之一。蟾毒灵抑制细胞生长是通过将细胞阻滞在G2/M期，而诱导骨肉瘤细胞凋亡主要与影响凋亡相关蛋白p53，caspase-3，Bax，Bcl-2的表达有关。 3.蟾毒灵对骨肉瘤细胞株的显著增殖抑制作用不但对骨肉瘤U-20S敏感细胞株有效，对氨甲喋呤耐药细胞株U-20S/MTX<300>也同样有效，其作用效果不受高表达DHFR的影响，提示蟾毒灵有希望成为对MTX耐药病人的候选治疗药物。