创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐的弧菌，存在于海水及海产品中，由Farmer等于1979年首先报道。本菌主要引起原发性败血症和严重的创口感染。败血症多与生食含菌的牡蛎等贝类海产品有关，尤其好发于肝硬化、血色素沉着症、地中海贫血等体内荷铁量过多的人群中，病死率超过50％。皮肤创口受海水中的创伤弧菌感染，常导致严重的组织坏死。创伤弧菌的确切致病机理至今尚未完全明了。溶细胞素是由结构基因vvhA编码的一种分子量为50,851Da的细胞外蛋白，对热不稳定，能溶解哺乳动物红细胞及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，是创伤弧菌向胞外释放的唯一细胞毒素，一直被认为是创伤弧菌重要的致病因子。 本文采用高保真PCR从创伤弧菌标准菌株GTC333中扩增全长的vvhA基因，T-A克隆测序后构建原核表达系统pET32a(+)-vvhA-BL21DE3，用不同浓度的IPTG诱导vvhA融合蛋白表达，SDS-PAGE检测vvhA融合蛋白分子量。其产物将作为创伤弧菌基因工程疫苗及诊断试剂盒的抗原。 实验方法 1．创伤弧菌的培养： 将日本岐阜大学医学院微生物教研室赠送的创伤弧菌标准菌株GTC333菌株涂布于血平板培养基上，于需氧环境37℃培养过夜，见细小白色菌落、周围有完全溶血环，革兰染色为阴性细小弧菌，经浙大医学院附属儿童医院检验科细菌自动分析仪检定为创伤弧菌。 2．创伤弧菌模板DNA制备： 采用常规苯酚—氯仿法提取创伤弧菌GTC333株DNA，经无DNA酶的RNA酶消浙江大学硕士学位论文李永涛化后，再次用苯酚一氯仿法提取的DNA溶于TE缓冲液中，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。3.PCR扩增: 根据创伤弧菌标准菌株GTC333vvhA参考核营酸序列和表达载体克隆位点内切酶图谱分析结果，自行设计引物，由上海博亚生物技术有限公司(BioAsia)合成。vv队基因引物序列如下:上游5仁GceG旦鱼工旦旦ATGAAGAAAATGAeTeTG一3/(BamHI)， 下游5仁GeeAAGeTTeTAGAGTTTGAeTTGTTG一3/(Hind山)。采用上海博彩生物科技有限公司(BBST)Pfu一Taq混合高保真PCR试剂盒扩增vvhA基因，PCR反应总体积为1 00林1，引物浓度为250 nmol/L，100 ng DNA模板。PCR反应参数:94oC5min，xl;94℃305，52oC3OS，72oCgOS，X 10;94oC3OS，52oC305，72oCIOOS(以后每循环增加105)，x25;72℃10min，xl。1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。4.丁一A克隆、测序与表达载体的构建: 采用BBST公司的T一A克隆试剂盒将扩增的目的片段克隆至pUCm一T载体中，转化于E.Col 1 DH SQ株并扩增，碱变性法提取质粒。获得满意的测序结果后，分别扩增含pUCm一T一vvhA和pET32a(+)的E.eoli DHS。，提取质粒后用双酶切获得目的基因片段与pET32a(+)连接后转化于E.coli BL21DE3，扩增、提取质粒后再次测序，并与报道的 vvhA基因核营酸序列进行同源性比较。5.重组蛋白表达与纯化: pET32a(+)一vvhA一BL21DE3在分别含1.0、0.5和0.1 mmol/L IPTG的LB培养基中震荡培养，诱导温度为37℃;IPTG诱导产物用超声波破碎，S000r/min4℃离心10 min后分别取上清和沉淀;采用10% SDS一PAGE检查目的蛋白的表达情况。用NTA亲和层析法(BBST)收集表达的目的蛋白。结果 PCR从创伤弧菌标准菌株GTC333株DNA模板中获得预期大小的vv队扩增条带。浙江人学硕卜学位论文李永涛2.核普酸序列分析: pUCm一T与pET32a卜)重组质粒中的创伤弧菌标准菌株GTC333株vvhA基因核若酸序列完全相同。与己报道的vvhA序列比较，核营酸序列同源性为95.970rk，据此推断氨基酸序列同源性为98.51%.3.目的融合蛋白的表达: 1.0、0.5和0.1 mmol/L工PTG均能很好地诱导重组vvhA的表达，表达产物主要存在于菌体超声破碎物离心后的沉淀中，表达量约占细菌总蛋白的30%一40%。 结论 本实验所克隆的创伤弧菌标准菌株GTC333株、，hA基因核昔酸序列与已报道相应序列比较，核营酸序列同源性为95.97%，氨基酸序列同源性为98.51%，上述结果表明，我们成功地从创伤弧菌基因组DNA中扩增、克隆了vvhA基因。 本实验构建的pET32a(+)一vvhA一BL21DE3系统在较低IPTG浓度时(0.1mm。1/L)也能很好地诱导重组vvllA的表达，其表达量高达细菌总蛋白3既一40?0左右，并主要以包涵体形式存在。 本实验成功地从创伤弧菌标准菌株中构建了vvhA高效原核表达系统，可为进一步的致病机制的研究和免疫诊断试剂盒的抗原作准备。