论文部分内容阅读
目的通过膝关节腔注射碘乙酸钠建立骨性关节炎模型,研究苗药熏蒸疗法对兔膝骨性关节炎模型关节液、滑膜及软骨中相关基因及蛋白的表达,探讨苗药熏蒸疗法基于SDF-1/CXCR4信号通路在骨性关节炎中的治疗作用。方法1.将36只新西兰大白兔随机分为正常组(A组),模型B-F组,共6组,每组6只。A组左膝关节腔注射0.2mL无菌生理盐水;模型B-E组左膝关节腔按照2.5、5、7.5、10mg/kg剂量各注射0.2mL碘乙酸钠溶液,模型F组注射剂量与E组相同,同时以30min/d分2次驱赶运动为干预因素。采用HE染色及骨性关节炎组织病理学评分(Mankin评分)观察各组软骨的病理改变。2.(1)实验分组:取健康成年新西兰大白兔50只,雌雄各半,体重(2.0±0.2)kg,随机分为5组,每组10只,分别为正常组、模型组、阳性对照组、早期干预组、苗药熏蒸组;(2)造模:除正常组外,其余4组采用膝关节腔注射碘乙酸钠的方法,建立膝骨性关节炎的模型;(3)实验干预:造模成功后,阳性对照组给予扶他林软膏外用治疗6周,苗药熏蒸组给予苗药熏蒸制备液治疗6周;(4)实验取材:治疗结束后,耳缘静脉注射空气行空气栓塞方法处死动物,采集样本。(5)观察指标:a.肉眼观察滑膜、软骨的大体变化;b.采用苏木素伊红染色的方法,光镜下观察滑膜、软骨的病理变化;c.采用免疫组化方法检测滑膜组织中IL-1β、TNF-α的阳性表达;d.采用Elisa检测方法,检测血清中MMP-3、MMP-9、MMP-13、VEGF的表达,检测关节液中SDF-1的表达;e.实时荧光定量 PCR 检测软骨组织中 MMP-3mRNA、MMP-9mRNA、MMP-1 3mRNA、VEGFmRNA的表达;f.蛋白免疫印迹法检测软骨组织中Col-2、聚集蛋白聚糖。结果1.与A组比较,B、C组差异无统计学意义(P>0.05),D、E、F组差异有统计学意义(P<0.05)。与E组比较,F组差异无统计学意义(P>0.05)。2.(1)肉眼观察结果:a.滑膜:与正常组相比,其他4组可见不同程度的滑膜增生,模型组最重,阳性对照组、早期干预组及苗药熏蒸组较模型组轻;b.软骨:与正常组相比,其他4组出现不同程度软骨损伤,模型组最重,阳性对照组、早期干预组及苗药熏蒸组较模型组有所改善。(2)滑膜及软骨的HE染色结果:与正常组相比,其他4组评分均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组、早期干预组及苗药熏蒸组评分均降低,差异有统计学意义(P<0.05);阳性对照组、早期干预组、苗药熏蒸组之间比较,评分相差不大,差异无统计学意义(P>0.05)。(3)免疫组化结果:与正常组相比,滑膜组织的IL-1β、TNF-α的IOD值均升高,差异有统计学意义(P<0.05),与模型组相比,阳性对照组、早期干预组、苗药熏蒸组的IOD值均降低,差异有统计学意义(P<0.05),阳性对照组、早期干预组、苗药熏蒸组组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(4)Elisa检测结果:与正常组相比,其他4组血清中MMP-3、MMP-9、MMP-13、VEGF的含量均升高,差异有统计学意义(P<0.05),与模型组相比,阳性对照组、早期干预组及苗药熏蒸组血清中MMP-3、MMP-9、MMP-13、VEGF含量均降低,差异有统计学意义(P<0.05),阳性对照组、早期干预组、苗药熏蒸组组间比较,差异无统计学意义(P>0.05);与正常组相比,其他4组关节液中SDF-1含量均升高,差异有统计学意义(P<0.05),与模型组相比,3个治疗组关节液中SDF-1含量均降低,差异有统计学意义(P<0.05),3组治疗组之间组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(5)RT-PCR检测结果:与正常组相比,其他4组软骨组织中MMP-3mRNA、MMP-9mRNA、MMP-13mRNA、VEGmRNAF均升高,差异有统计学意义(P<0.05),与模型组相比,3组治疗组软骨组织中MMP-3mRNA、MMP-9mRNA、MMP-13mRNA、VEGmRNAF均降低,差异有统计学意义(P<0.05),3组治疗组之间组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(6)WB检测结果:与正常组相比,其他4组软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05),与模型组相比,3组治疗组软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖蛋白表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05),3组治疗组软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖蛋白表达组间比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论1.模型D组药物浓度7.5mg/kg为建立OA模型的最小有效药物剂量,且模型建立方法操作简单、创伤小,能够保证膝关节稳定性及实验动物的成活率。2.(1)SDF-1可以诱导兔骨性关节炎关节软骨蜕变加重;(2)苗药熏蒸疗法能够延缓兔骨性关节炎模型滑膜炎症及软骨的退变;(3)苗药熏蒸组及扶他林软膏对照组在治疗兔骨性关节炎上无明显差异,临床上可以选择苗药熏蒸疗法替代扶他林软膏的外用,因为扶他林软膏在临床中存在治疗周期,不能长期使用,长期使用存在明显的副作用;(4)苗药熏蒸疗法可能是通过阻断SDF-1与其受体 CXCR4 结合,从而达到抑制 MMP-3、MMP-9、MMP-13、VEGF、SDF-1 等细胞因子的表达,从而达到延缓骨性关节炎发展的作用,起到治疗作用。