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过量的活性氧（ROS）水平对身体有害,ROS的形成和消除之间的不平衡在许多人类疾病的发病机理中起作用,例如缺血/再灌注损伤、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、癌症和过敏等。谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和超氧化物歧化酶（SOD）是用于预防ROS诱导的损伤的重要抗氧化酶。SOD催化超氧阴离子(O2·-)歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）,然后通过GPx将H2O2分解成水。这两种抗氧化酶除了具有协同的催化功能之外,它们又彼此保护,可以更有效地去除活性氧物质,保护细胞免受损伤,并维持活性氧物质的正常代谢。庞贝蠕虫来源SOD（ApSOD）是从海底热泉中的庞贝蠕虫中分离纯化的一种金属酶,其金属辅助因子为Cu和Zn。与人SOD（HsSOD）相比,ApSOD具有更高的稳定性,更适合科学研究和医学应用。人胃肠道来源GPx（hGPx2）是一种硒蛋白,硒蛋白的催化功能依赖于其活性中心的硒代半胱氨酸（Sec）,天然的Sec由作为终止密码子的UGA编码,而且需要复杂的编码机制才能将UGA低效的翻译为Sec。因此,细胞利用自身的机制很难大量表达外源含硒GPx。我们课题组在之前的研究中,利用半胱氨酸营养缺陷表达系统和单一蛋白质生产（SPP）系统联合应用来表达GPx,成功的将Sec替代Cys插入到肽链中获得了较高活力的含硒GPx,然而这种方法只能获得缺失Cys的突变体,再加上成本高且耗时,不利于对含硒蛋白的广泛研究。本研究为了制备具有协同作用的hGPx2和ApSOD活性的双功能酶,选择了一段含21个氨基酸的柔性肽Ser（Gly4Ser）*4作连接Linker,其中甘氨酸分子量最小,肽链最短,可提高Linker的柔性度,而丝氨酸是亲水性最强的氨基酸,利于蛋白保持可溶性。本研究选用的Linker比本课题组之前使用的增加了5个氨基酸GGGGS,适当延长Linker可能更有利于减弱hGPx2和ApSOD对彼此结构的影响。先用基因工程方法获得hGPx2和ApSOD基因,再将两者构建在分泌型原核表达载体pRSF Duet-1上,然后,将构建成功的质粒与装载Sec掺入蛋白质的组件的质粒共转化UAG工程菌,在亚硒酸钠存在下诱导表达。UAG工程菌即琥珀型终止缺陷大肠杆菌C321.ΔA.exp,是将大肠杆菌中负责UAG终止的释放因子1（RF1）去除,并将基因组中321个UAG终止密码子替换为UAA终止密码子的工程菌,使得UAG在这一菌株中真正地被赋予编码氨基酸的能力。最终通过镍亲和层析法分离纯化出具有协同作用的hGPx2和ApSOD活性的双功能融合蛋白。该融合蛋白具有更高的GPx和SOD活性。每种酶都具有特定的不可替代的功能,它们以协同的方式起作用,更好地保护机体免受损伤。因此,多功能抗氧化剂的设计和生成将成为人工酶领域发展的重要课题。我们预期具有协同作用的肽酶有望用于治疗人类疾病,并且在医学中作为有效的抗氧化剂具有潜在的应用。