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[研究背景]缺血性脑卒中严重危害人类健康,是目前继心血管病之后的第二大死因。越来越多的研究表明,氧化应激在脑缺血发病中占据重要地位,减轻氧化应激反应是脑缺血的一个重要治疗策略。Nrf2 (nuclear transcription factor NF-E2-related factor 2)是调节细胞氧化还原状态的重要转录因子。作为内源性抗氧化防御系统的主要调节因子,Nrf2能诱导一系列细胞保护基因和解毒基因的表达。在对抗氧化应激损伤方面具有很大潜力。Nrf2转移入核后可启动受ARE调控的下游基因如血红蛋白氧合酶(hemeoxygenase, HO-1)、谷胱甘肽半胱氨酸连接酶催化亚基(glutathione cysteine ligase regulatory subunit, GCLC)、谷胱甘肽半胱氨酸连接酶调节亚基(glutathione cysteine ligase modulatory subunit, GCLM)等的转录,从而保护细胞免受氧化损伤。众多的证据表明,Nrf2-ARE (antioxidant response element)通路在缺血／再灌注脑损伤的发病机制中发挥着重要作用,是脑缺血发生发展过程中重要的调控靶点。寻找新型高效的Nrf2诱导剂可为脑缺血的治疗提供新的有效候选药物。我们的前期研究发现,大蒜中含有的有机硫成分S-烯丙基半胱氨酸(S-allyl cysteine, SAC)为强Nrf2诱导剂,初步的细胞实验结果发现该化合物可保护OGD(oxygen and glucose deprivation)所致原代皮层神经元氧化应激损伤,且此保护作用与Nrf2-ARE通路诱导密切相关。本研究通过OGD损伤原代皮层神经元模型及C57BL/6小鼠脑缺血模型,分别从体内体外研究该化合物对OGD所致脑缺血细胞及动物模型的保护作用及机制,从抗氧化角度阐明其作用机理。为脑缺血的治疗提供一种新策略,为筛选Nrf2-ARE通路诱导剂治疗缺血性脑血管疾病提供新思路和途径。[研究目的]研究SAC通过调节Nrf2-ARE信号通路对缺血性脑损伤的神经保护作用并探讨其作用机制。[研究方法]体外实验：1.在原代皮层神经元中给予不同浓度的SAC干预8h和24 h以及选择50μM的SAC作用于神经元不同时间后,Western blot法检测Nrf2蛋白表达以及下游蛋白(GCLC,GCLM, HO-1)的表达水平；用电泳迁移率的方法检测Nrf2-DNA结合活性。观察SAC是否激活Nrf2-ARE信号通路。2.在原代皮层神经元中给予不同浓度的SAC干预2h后,采用糖氧剥夺(OGD)损伤60 min再灌注24h。用MTT法检测细胞存活率,化学显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,Hoechst33258和Tunel染色检测细胞凋亡水平。观察SAC对OGD诱导原代皮层神经元损伤的保护作用。用Western blot法检测凋亡通路各蛋白(p-JNK, p-p38, caspase-3)的表达水平,观察SAC能否阻断OGD所致JNK/p38凋亡信号通路的激活。3. shRNA干扰Nrf2表达,然后给予SAC (50 μM)干预,8h和24 h后用Western blotting法检测Nrf2及下游蛋白(HO-1,GCLC,GCLM)的表达水平。检测Nrf2被干扰后SAC是否还可以激活Nrf2-ARE通路。另外,shRNA干扰Nrf2表达,SAC (50 μM)干预2h,OGD损伤60 min,培养24 h后采用MTT法和LDH法检测细胞的存活率及Hoechst33258染色观察细胞发生凋亡的情况。检测Nrf2被干预后,SAC的保护作用是否还存在,以验证SAC的保护作用是否通过激活Nrf2-ARE通路实现。体内实验：1.野生型小鼠(Nrf2+/+)和Nrf2敲基因小鼠(Nrf2-/-)腹腔注射SAC (300 mg/kg) 30 min后,MCAO法制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型,再灌注24h后取小鼠脑组织,免疫组化法观察Nrf2在皮层和海马中的分布情况；Western blot法检测Nrf2和下游蛋白(GCLC, GCLM,HO-1)在皮层和海马中的表达水平。2. MCAO法制备小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,采用TTC染色法观察脑梗死面积,神经病学评分观察小鼠的行为学变化,HE和Nissl染色观察皮层和海马神经元的形态学变化。3.制备MCAO模型前30 min,腹腔注射SAC (300 mg/kg),缺血再灌注24 h后,将小鼠麻醉处死,取小鼠全脑或皮层和海马。用TUNEL染色法检测小鼠皮层和海马凋亡细胞数的变化,Western blotting法检测凋亡信号通路各蛋白(p-JNK, p-p38, caspase-3)表达情况。检测SAC是否可阻断MCAO所致JNK/p38凋亡信号通路的激活。[实验结果]1.在原代培养的皮层神经元中SAC可呈剂量和时间相关性的诱导Nrf2蛋白表达,并促进Nrf2下游蛋白(GCLC, GCLM, HO-1)的表达。2.对原代培养的皮层神经元进行OGD损伤后,SAC能够增加细胞存活率,减少乳酸脱氢酶释放量,减少凋亡细胞数目,可阻断p-JNK, p-p38诱导的细胞凋亡。3.采用shRNA将原代皮层神经元中Nrf2阻断后,SAC干预组中Nrf2及下游基因(GCLC, GCLM, HO-1)的表达不再升高；SAC的保护作用明显被阻断,表明SAC是通过Nrf2依赖的方式来保护神经元免受氧化应激损伤。4.SAC可诱导野生型小鼠(Nrf2+/+)皮层和海马Nrf2及其下游蛋白(GCLC, GCLM, HO-1)的表达,而对敲基因小鼠(Nrf2-/-)在IR, IR+SAC两组中Nrf2以及下游蛋白(GCLC, GCLM, HO-1)的表达相对Sham组来说无明显差异。5.对野生型小鼠(Nrf2+/+)给予SAC后脑梗死面积明显减少,而对敲基因小鼠(Nrf2-/-)脑梗死面积在IR, IR+SAC两组无差异且都较野生型小鼠严重；野生型小鼠(Nrf2+/+)给予SAC后皮层和海马中细胞形态学发生了明显改善,而对敲基因小鼠(Nrf2-/-)皮层和海马部位凋亡细胞数在IR, IR+SAC两组无差异且都较野生型小鼠增多。6.在野生型小鼠(Nrf2+/+)中,SAC干预组能明显减少细胞凋亡数目以及明显降低凋亡信号通路各蛋白(p-JNK, p-p38, caspase-3)的表达；而在敲基因小鼠(Nrf2-/-)中SAC的这种保护作用消失。[结论]SAC对OGD诱导的原代培养皮层神经元氧化应激损伤以及小鼠脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用,此保护作用通过激活Nrf2-ARE信号通路实现。