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毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来发展迅速的一种真核表达体系，具有表达量高、培养成本低等特点，得到了广泛的应用。来源于酿酒酵母的Flo1锚定的展示系统是高效、常用的酵母展示系统，可实现功能蛋白N端锚定、C端游离的展示系统称为FFD展示系统。FFD是絮凝素Flo1的N端絮凝展示功能区，可非共价结合于酵母细胞壁中的甘露糖成分上从而将功能蛋白N端固定在酵母细胞壁上。基于FFD系统展示的外源酶C端游离在酵母细胞外，对于活性中心位于C端的某些酶蛋白尤为重要，在实现酶固定化的同时，不影响其催化功能，因而在众多酵母展示系统中独树一帜。本论文利用FFD锚定系统分别实现了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）在毕赤酵母细胞表面的展示，建立FFD展示效果的评价体系并研究FFD锚定系统展示效果的影响因素。（1）FFD表面展示蛋白定量本研究利用FFD展示增强型绿色荧光蛋白（EGFP）以及南极假丝酵母脂肪酶B（CALB），构建了使用诱导型启动子AOX1的重组菌GS115/pKFS-EGFP、GS115/pKFS-EGFP-CALB和GS115/pKFS-CALB-EGFP。通过诱导发酵表达外源蛋白，检测外源蛋白的荧光强度、蛋白量和酶活，关联上清中的EGFP荧光强度与融合蛋白的蛋白量，并利用获得的关系计算展示在细胞表面的融合蛋白的蛋白量，建立利用荧光强度表征展示蛋白量的计算公式。计算出GS115/pKFS-EGFP展示的融合蛋白最高达9×104蛋白数/细胞，而GS115/pKFS-EGFP-CALB和GS115/pKFS-CALB-EGFP展示的融合蛋白最高达2×104蛋白数/细胞。（2）不同浓度甘露糖对FFD展示系统展示效果的影响进一步研究为了在非甲醇诱导的条件进行实验，构建了利用组成型启动子GAP的重组菌GS115/pPICZA-GAP-FS-EGFP。在不同甘露糖浓度（2%、3%、4%、5%、6%）的YPM培养基以及作为对照的YPD培养基中进行发酵并检测EGFP的荧光强度。发现随着培养基中的甘露糖浓度的提高会提高FFD展示外源蛋白的量，最高展示荧光强度在甘露糖浓度为6%获得，为1.71×107RFU/mL适当提高培养基中甘露糖的量会提高展示效果。（3）不同的初始培养pH对FFD展示系统展示效果的影响首先研究培养基的pH对基于FFD系统的组成型重组菌GS115/pPICZA-GAP-FS-EGFP展示外源蛋白的影响，发现在酵母生长范围内pH5.0、pH6.0、pH7.0以及pH8.0几个培养pH中最适的培养pH是pH5.0，在pH5.0的展示荧光强度约为pH6.0、pH7.0、pH8.0的1.125、1.29、1.5倍。接着研究了诱导型重组菌GS115/pKFS-EGFP、 GS115/pKFS-EGFP-CALB和GS115/pKFS-CALB-EGFP在不同pH5.0、 pH6.0、 pH7.0下EGFP荧光强度与CALB酶活，发现趋势与重组菌GS115/pPICZA-GAP-FS-EGFP获得的结果一致，结果表明在pH5.0FFD展示系统具有最高的展示外源蛋白效果。（4）FS重复区A重复单元缺失对FFD系统展示外源蛋白效果的影响本论文还研究了缺失FS上重复区A重复单元的缺失对FFD展示外源蛋白的影响。使用非特异重叠延伸PCR的方法构建了GS115/pKFS-EGFP (ΔA6-13)、GS115/pKFS-EGFP (ΔA5-13)、GS115/pKFS-EGFP (ΔA4-13)、GS115/pKFS-EGFP (ΔA3-13)4个分别缺失了8、9、10、11个重复A区重复单元的缺失突变株。通过检测并比较EGFP荧光强度的变化，发现随着重复区A缺失的单元数增多，FFD展示外源蛋白的效果会降低。同时研究发现缺失重复A区单元数越多的重组菌的絮凝效果会提高。本研究为阐明基于FFD锚定的毕赤酵母细胞表面展示机制以及影响因素提供了实验基础，并为改善和提高基于FFD系统的毕赤酵母表面展示提供了理论指导，对实现脂肪酶在酵母细胞的高效展示进而提高展示酶的催化效率也有一定的借鉴意义。