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第一部分TCDD致胎鼠腭裂miR-381-3p的下调抑制MEPM细胞成骨分化的实验研究目的:检测TCDD致胎鼠腭裂模型中miR-381-3p的表达变化,并探讨其是否与TCDD抑制胎鼠腭间充质细胞(mouse embryonic palatal mesenchymal(MEPM)cells)成骨分化相关。方法:使用随机数字表将32只孕鼠在胚胎日第10.5天(embryonic day10.5,E10.5)完全随机分为对照组和TCDD组,TCDD处理组在胚胎日第10.5天时,给予孕鼠TCDD(28μg/kg)一次性灌胃,对照组孕鼠同样根据体重给予相同体积的玉米油一次性灌胃。两组在E13.5和E14.5分别从孕鼠子宫内取出胎鼠剪取腭突组织,用于提取组织miRNAs和总蛋白。MEPM细胞在体外用含TCDD10nmol/L的完全培养基处理第0、0.5、1、2和3天后分别提取细胞miRNAs和总蛋白。MEPM细胞转染miR-381-3p抑制物(inhibitor)和模拟物(mimics)48h后分别提取细胞miRNAs和总蛋白。miR-381-3p在腭突组织和MEPM细胞中的相对表达量使用实时荧光定量PCR检测,蛋白印迹法检测腭突组织和MEPM细胞内成骨分化标志物RUNX2与OPN相对表达量。结果:E13.4和E14.5时,TCDD组胎鼠腭突组织miR-381-3p表达相对低于对照组(P<0.05,P<0.05);E14.5时,TCDD组胎鼠腭突中RUNX2和OPN蛋白表达相对低于对照组(P<0.05,P<0.01)。TCDD处理MEPM细胞后第0.5和1天,miR-381-3p与第0天比较表达明显受到抑制(P<0.001,P<0.01),第2天较第1天miR-381-3p表达量明显回升(P<0.01);第1、2和3天RUNX2表达相较于第0天明显降低(P<0.01,P<0.001,P<0.001);OPN表达在第1、2和3天相对于第0天明显降低(P<0.05,P<0.001,P<0.01)。MEPM细胞转染miR-381-3p抑制物48小时后,RUNX2及OPN的表达较抑制对照组明显降低(P<0.01,P<0.01);MEPM细胞转染miR-381-3p模拟物48小时后,RUNX2及OPN的表达均高于模拟对照组(P<0.05,P<0.05)。结论:在TCDD致胎鼠腭裂模型中,miR-381-3p表达下调可能与胎鼠腭间充质细胞成骨分化受到抑制有关。第二部分TCDD诱导的胎鼠腭裂腭突组织细胞周期相关分子的表达变化目的:利用TCDD构建胎鼠腭裂模型,检测腭突组织中细胞周期相关分子的表达变化,初步探寻细胞周期相关分子是否参与胎鼠腭裂的形成及可能的机制。方法:在胚胎日第10天(the embryonic day10.5,E10.5)时用随机数字表法将48只C57BL/6J孕鼠分为TCDD处理组与对照组,每组24只,胎鼠腭裂造模方法同《第一部分》,分别在E13.5、E14.5及E15.5时处死孕鼠,剪取各组胎鼠腭突组织,用以提取总核糖核酸和总蛋白,用转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法分别检测细胞周期相关分子的m RNA或蛋白表达水平。以不同浓度TCDD(0.01、0.1、0.5和1 nmol/L)处理人肾胚293t细胞(HEK293t),MTT实验检测不同浓度TCDD干扰后细胞增殖活力变化。结果:E13.5、E14.5和E15.5,干扰素调节因子6(Irf6)蛋白在对照组(1.26±0.13、1.67±0.14、1.42±0.15)较TCDD组(0.81±0.08、1.04±0.02、0.86±0.12)表达水平高(P=0.0471、0.0146、0.0241)。E14.5和E15.5时,P21蛋白在对照组(2.26±0.21、1.99±0.21)较TCDD组(1.43±0.12、0.93±0.22)表达水平高(P=0.0273、0.0278)。细胞周期相关分子的m RNA表达水平:各个时间点,细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在对照组(1.00±0.02、0.94±0.03、1.11±0.09)表达水平均较TCDD组(0.28±0.01、0.33±0.06、0.88±0.01)高(P值均<0.001);TCDD组cyclin E1、cyclin A2、cyclin B1、细胞周期蛋白依赖性激酶6(Cdk6)、Cdk2、Cdk1表达均较对照组高,差异有统计学意义(P均<0.05);E13.5,cyclin B1和E15.5 Cdk2m RNA表达在两组间无统计学差异(P>0.05)。HEK293细胞增殖力,TCDD(0.1nmol/L)处理第1、2、3天(0.70±0.05、1.05±0.03、1.39±0.04)后较对照组(0.49±0.04、0.98±0.03、1.55±0.02)增加(P=0.0198、0.1320、0.0247)。结论:TCDD下调Irf6和P21蛋白的表达水平,干扰细胞周期相关分子正常表达,这可能干扰了MEE细胞退出细胞周期及增殖活力。细胞周期相关分子在腭发育过程中时空表达的紊乱可能与TCDD诱导腭裂的发生机制有关。第三部分14-3-3σ蛋白在TCDD致胎鼠腭裂中的作用机制的初步研究目的:检测14-3-3σ蛋白在TCDD致胎鼠腭裂模型中腭突组织内的表达部位和腭发育关键时期的表达变化,探讨其在腭裂形成中可能存在的机制。方法:实验分组和胎鼠腭裂模型构建方法同《第二部分》,各组孕鼠分别在E13.5、E14.5及E15.5剪取胎鼠腭突和胎头。胎头固定包埋于石蜡后制作切片用于常规HE染色,免疫组化检测14-3-3σ蛋白在胎鼠腭部的表达部位;腭突组织标本―80℃储存用于提取总RNA和总蛋白;分别用反转录实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-QPCR)和蛋白免疫印迹检测14-3-3σ的m RNA和蛋白的相对表达量,P53蛋白和磷酸化P53蛋白的相对表达量。结果:E14.5和E15.5,14-3-3σ蛋白于对照组主要表达在MEE细胞及残余上皮岛细胞内,TCDD组主要表达于腭内侧上皮细胞。E13.5、E14.5和E15.5,14-3-3σm RNA在TCDD组表达量为(1.92±0.18,2.68±0.20,5.84±0.11)较对照组(0.82±0.32,0.98±0.25,3.84±0.36)升高(P<0.05,P<0.01,P<0.05)。E13.5、E14.5和E15.5,14-3-3σ蛋白表达量在TCDD组(2.29±0.07,3.15±0.07,2.02±0.19)较对照组(1.00±0.05,1.06±0.04,0.76±0.05)显著升高(P<0.001,P<0.001,P<0.01)。E13.5,P53蛋白在TCDD组表达量(1.18±0.04)较对照组(1.00±0.03)升高(P<0.05)。磷酸化P53蛋白于E13.5和E14.5在TCDD组表达(2.26±0.08,2.11±0.02)比对照组(0.96±0.03,1.59±0.03)显著升高(P均<0.001)。结论:E13.5、E14.5和E15.5,TCDD组腭突组织14-3-3σ蛋白表达升高,可能是腭发育早期TCDD作用下P53通路激活、引起细胞周期阻滞所致。且TCDD组14-3-3σ蛋白表达升高,可能抑制EMT,使得MEE持续存在,干扰了正常的腭发育进程,导致腭裂形成。