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广藿香(Pogostemon ca blin(Blanco) Benth.)是著名的岭南道地药材，十大广药之一，是临床常用的芳香化湿药。从广霍香中提取的广霍香油是医药工业和轻化工业的重要原料，市场需求量大。广蕃香是获得广惹香油的唯一天然来源，其最主要的成分是广霍香醇(Patchoulol)，又称为"百秋李醇"，是一种代表性的倍半i陆类物质，具有很好的神经保护、抗流感病毒、抗多种真菌、抗肿瘤、抗炎症等生物活性，更是我国历版药典中用于评价广霍香药材及广霍香油质量的指标成分。因此，广霍香醇的生物合成及其动态积累研究备受关注。随着功能基因组学、植物代谢检测分析技术和多组学技术的应用，广惹香i陆类次生代谢模式和厂莓香醇的生物合成途径被逐渐解析。研究表明，广霍香醇合酶(Patchoulol synthase,PatPTS)能直接催化法昵基焦磷酸(FPP)生成倍半惦类终产物广霍香醇，对于广霍香醇的合成积累最为关键。
目前对广霍香的脑类合成在转录调控方面的研究尚没有报道，特别是缺乏直接剖析转录因子如何调控PatPTS的转录表达的研究，相关的转录调控机制和互作网络也未得到解析。因此，本研究率先开展了调控广霍香醇生物合成的转录因子的挖掘，采用三代测序技术构建了广霍香全长转录本数据库，结合酵母杂交技术，以PatPTS的启动子作为靶调控位点，通过文库筛选、分离克隆和体内外验证来获得一系列转录因子，并联合植物基因工程和代谢分析对其功能进行深入研究，以阐明广霍香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制，为广霍香优良品种培养及广霍香醇合成研发工作提供理论支撑和技术参考。研究的技术方法和结果概况如下:
1广藿香全长转录本数据库及酵母杂交文库的构建和分析
1.1基于PacBio三代测序的转录本识别和分析
采用PacBio单分子实时测序技术(Single molecular real-time,SMRT)构建了广霍香全长转录组参考图谱，重构获得了82，335个全长转录本，共有65，826个转录本在Nr、Swissprot、GO、KEOG等数据库获得注释，注释率为79.95％。其中注释为恼类生物合成相关途径相关的转录本有103个，共包括广蓄香醇合成相关关键酶基因16个，并分析获得3，176个转录因子序列，分别属于90个不同的家族。
1.2酵母杂交cDNA文库的构建和质量分析
利用Invitrogen的CloneMinerⅡ cDNA Library Construction Kit构建来广霍香高质量酵母杂交cDNA文库，其库容为8.6×106 CFU，重组率为＞95％，满足次级文库要求，可用于后续文库筛选试验。
2 PatPTS启动子克隆及其转录调控因子的筛选
2.1 PatPTS及其启动子的克隆分析
从广藿香转录组数据库筛选获得PatPTS的全长转录本，设计引物克隆获得PatPTS基因1，659 bp ORF序列和3，392 bp gDNA序列，以及854 bp启动子序列。采用PlantCARE和New PLACE等数据库对该启动子进行顺式作用元件分析，发现该启动子含有转录起始核心元件TATABOX、增强子核心元件CAATBOX等必须元件，同时含有E-BOX、I-BOX等多种转录因子的结合元件，还含有JA、ABA、Ethylen(乙烯， ET)等激素响应元件。
2.2结合PatPTS启动子的转录因子的初步筛选和鉴定
通过酵母单杂交(YIH)文库筛施以PatPTS的启动子为诱饵从广霍香cDNA文库中获得约200个候选基因片段。通过NCBI，Uniprot等数据库进行候选片段注释分析，从广霍香的全长转录本数据库提取候选基因的全长转录本进行分析及克隆;然后构建酵母AD载体，并与诱饵质粒共转至酵母Y187重复酵母单杂交验证，结果表明PatDREB、PatERF061、PatSWC4、PatASIL2、PatGATA17和PatGIS2等6个蛋白在酵母体内可以结合PatPTS的启动子。
3转录因子调节PatPTS基因表达参与广霍香醇合成调控的机制
3.1广茬香MYC2转录因子的克隆及转录调控研究
(1)据文献报道MYC2转录因子在植物脂类化合物的代谢合成中具有重要的调控作用，因此本研究还对广霍香中MYC2转录因子进行了克隆，并探究其对PatPTS的转录调控功能进行分析。从广霍香的全长转录组数据库筛选出11条注释为MYC的全长转录本，设计引物克隆获得8个MYC编码序列，对序列进行生物信息学分析表明PatMYC2a、PatMYC2b1和PatMYC2b2具有高度保守bHLH-MYC-N、bHLH-Zip和ACT-like功能域。这3个PatMYC2在拟南芥原生质体中均定位于细胞核，均具有转录激活活性，缺失表达实验表明PatMYC2a和PatMYC2b2的转录激活功能域为bHLH-MYC-N蛋白保守结构。RT- qPCR分析表明3个PatMYC2在不同组织部位均有表达，低温和光照处理后3个PatMYC2呈现相似的表达模式。
(2)在本氏烟中进行的双荧光素酶(Dual-luc)实验和在广霍香叶片中瞬时过表达实验表明分别过表达PatMYC2a和PatMYC2b2能够激活PatPTS启动子的活性并促进PatPTS基因转录表达，同时可激活广霍香醇合成通路PatFPPS、PatlPPl、PatMVD、PatPMK、PatHMGS和PatAACT等多个关键酶基因的表达来促进叶片中广霍香醇的合成积累。
3.2 DREB转录因子PatDREB和PatERF061介导的广霍香醇合成调控机制研究
Y1H实验中筛选得到的两个AP2/E盯家族转录因子均含有一段60个左右氨基酸构成的AP2保守结构域，均属于DREB亚家族，具有该亚家族的保守位点，其中PatDREB属于该亚族A-4组， PatERF061则属于A-6组。PatDREB在拟南芥原生质体的细胞核定位表达，而PatERF061则在细胞核和细胞质均有表达。两个DREB在不同组织均有表达，而转录表达水平受MeJA诱导，但表达模式有所差异。
3.3 MYB related转录因子Pa tSWC4调控广霍香醇合成机制研究
(1) YIH筛选获得的PatSWC4为MYB related家族转录因子，含有SANT/Myb-like domain ofDAMP1和DNA methyltransferase1-associated protein1(DMAP1)两个保守功能域。Pa tSWC4主要于细胞核定位表达，在广霍香各个组织部位均有表达，且其转录表达水平受MeJA诱导。Y2H和Dual-luc实验结果表明， PatSWC4能激活PatPTS启动子的活性，添加MeJA后，激活作用更显著提高; PatJAZ4通过与PatSWC4结合而抑制其转录激活功能，而施加MeJA则能逆转这种抑制作用。在广霍香叶片中瞬时过表达PatSWC4，能激活广霍香醇合成酶PatPTS和MVA途径PatFPPS等关键酶基因的表达;另外广霍香醇合成相关转录因子PatDREB、PatERFO61和3个PatMYC2的表达也显著提高，从而促进了叶片中广霍香醇的合成和积累。
(2) Y2H和Dual-1uc实验表明PatSWC4能分别与PatDREB、PatERF061形成转录复合体，复合体能激活PatPTS的启动子活性，外源MeJA能抑制其激活作用。PatJAZ4能分别与PatSWC4、PatDREB、PatERF061结合，抑制转录复合体的形成，从而抑制PatPTS启动子的活性，这种作用在施加MeJA后可消除，甚至逆转。将PatSWC4分别与PatDREB、Pa tERF061;在广霍香叶片中进行瞬时共过表达，也能显著促进广霍香醇的合成和积累。
3.4 Trihelix转录因子PatASIL2调控广霍香醇合成机制研究
3.5两个铸指蛋白可能调控广茬香醇的合成
综上所述，为挖掘鉴定广霍香醇生物合成的转录调控因子，本研究首先构建了广霍香的全长转录组和酵母杂交文库，根据转录组注释分离克隆了广霍香MYC2转录因子，并研究其在广霍香醇生物合成中的重要作用，以PatPTS的启动子为诱饵筛选并首次鉴定了6个特异性调控PatPTS基因表达进而参与调控广霍香醇生物合成的转录因子，并利用瞬时过表达对其功能进行验证分析。PatDREB、PatERFO61、PatSWC4和Pa tASJL2的基因表达和转录调控功能受外源MeJA诱导，可能为JA信号通路的下游响应转录因子。蛋白互作结果还表明两个DREB转录因子能够与MYB-like转录因子(PatSWC4、PatASJL2)形成转录复合体调控广霍香醇的合成。同时PatGATA17和PatGIS2作为调控广霍香醇合成的候选转录因子开展初步鉴定。本研究首次筛选获得多个转录因子，功能分析揭示了其调控广霍香醇生物合成的可能模型，不仅促进从转录调控上揭示广霍香醇的生物合成分子机制，在广霍香响应激素诱导的分子调控网络机理的解析取得突破，而且有助于广霍香及广霍香挥发油的质量控制，为利用代谢调控手段提高药用植物活性成分合成提供理论基础和应用借鉴。
目前对广霍香的脑类合成在转录调控方面的研究尚没有报道，特别是缺乏直接剖析转录因子如何调控PatPTS的转录表达的研究，相关的转录调控机制和互作网络也未得到解析。因此，本研究率先开展了调控广霍香醇生物合成的转录因子的挖掘，采用三代测序技术构建了广霍香全长转录本数据库，结合酵母杂交技术，以PatPTS的启动子作为靶调控位点，通过文库筛选、分离克隆和体内外验证来获得一系列转录因子，并联合植物基因工程和代谢分析对其功能进行深入研究，以阐明广霍香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制，为广霍香优良品种培养及广霍香醇合成研发工作提供理论支撑和技术参考。研究的技术方法和结果概况如下:
1广藿香全长转录本数据库及酵母杂交文库的构建和分析
1.1基于PacBio三代测序的转录本识别和分析
采用PacBio单分子实时测序技术(Single molecular real-time,SMRT)构建了广霍香全长转录组参考图谱，重构获得了82，335个全长转录本，共有65，826个转录本在Nr、Swissprot、GO、KEOG等数据库获得注释，注释率为79.95％。其中注释为恼类生物合成相关途径相关的转录本有103个，共包括广蓄香醇合成相关关键酶基因16个，并分析获得3，176个转录因子序列，分别属于90个不同的家族。
1.2酵母杂交cDNA文库的构建和质量分析
利用Invitrogen的CloneMinerⅡ cDNA Library Construction Kit构建来广霍香高质量酵母杂交cDNA文库，其库容为8.6×106 CFU，重组率为＞95％，满足次级文库要求，可用于后续文库筛选试验。
2 PatPTS启动子克隆及其转录调控因子的筛选
2.1 PatPTS及其启动子的克隆分析
从广藿香转录组数据库筛选获得PatPTS的全长转录本，设计引物克隆获得PatPTS基因1，659 bp ORF序列和3，392 bp gDNA序列，以及854 bp启动子序列。采用PlantCARE和New PLACE等数据库对该启动子进行顺式作用元件分析，发现该启动子含有转录起始核心元件TATABOX、增强子核心元件CAATBOX等必须元件，同时含有E-BOX、I-BOX等多种转录因子的结合元件，还含有JA、ABA、Ethylen(乙烯， ET)等激素响应元件。
2.2结合PatPTS启动子的转录因子的初步筛选和鉴定
通过酵母单杂交(YIH)文库筛施以PatPTS的启动子为诱饵从广霍香cDNA文库中获得约200个候选基因片段。通过NCBI，Uniprot等数据库进行候选片段注释分析，从广霍香的全长转录本数据库提取候选基因的全长转录本进行分析及克隆;然后构建酵母AD载体，并与诱饵质粒共转至酵母Y187重复酵母单杂交验证，结果表明PatDREB、PatERF061、PatSWC4、PatASIL2、PatGATA17和PatGIS2等6个蛋白在酵母体内可以结合PatPTS的启动子。
3转录因子调节PatPTS基因表达参与广霍香醇合成调控的机制
3.1广茬香MYC2转录因子的克隆及转录调控研究
(1)据文献报道MYC2转录因子在植物脂类化合物的代谢合成中具有重要的调控作用，因此本研究还对广霍香中MYC2转录因子进行了克隆，并探究其对PatPTS的转录调控功能进行分析。从广霍香的全长转录组数据库筛选出11条注释为MYC的全长转录本，设计引物克隆获得8个MYC编码序列，对序列进行生物信息学分析表明PatMYC2a、PatMYC2b1和PatMYC2b2具有高度保守bHLH-MYC-N、bHLH-Zip和ACT-like功能域。这3个PatMYC2在拟南芥原生质体中均定位于细胞核，均具有转录激活活性，缺失表达实验表明PatMYC2a和PatMYC2b2的转录激活功能域为bHLH-MYC-N蛋白保守结构。RT- qPCR分析表明3个PatMYC2在不同组织部位均有表达，低温和光照处理后3个PatMYC2呈现相似的表达模式。
(2)在本氏烟中进行的双荧光素酶(Dual-luc)实验和在广霍香叶片中瞬时过表达实验表明分别过表达PatMYC2a和PatMYC2b2能够激活PatPTS启动子的活性并促进PatPTS基因转录表达，同时可激活广霍香醇合成通路PatFPPS、PatlPPl、PatMVD、PatPMK、PatHMGS和PatAACT等多个关键酶基因的表达来促进叶片中广霍香醇的合成积累。
3.2 DREB转录因子PatDREB和PatERF061介导的广霍香醇合成调控机制研究
Y1H实验中筛选得到的两个AP2/E盯家族转录因子均含有一段60个左右氨基酸构成的AP2保守结构域，均属于DREB亚家族，具有该亚家族的保守位点，其中PatDREB属于该亚族A-4组， PatERF061则属于A-6组。PatDREB在拟南芥原生质体的细胞核定位表达，而PatERF061则在细胞核和细胞质均有表达。两个DREB在不同组织均有表达，而转录表达水平受MeJA诱导，但表达模式有所差异。
3.3 MYB related转录因子Pa tSWC4调控广霍香醇合成机制研究
(1) YIH筛选获得的PatSWC4为MYB related家族转录因子，含有SANT/Myb-like domain ofDAMP1和DNA methyltransferase1-associated protein1(DMAP1)两个保守功能域。Pa tSWC4主要于细胞核定位表达，在广霍香各个组织部位均有表达，且其转录表达水平受MeJA诱导。Y2H和Dual-luc实验结果表明， PatSWC4能激活PatPTS启动子的活性，添加MeJA后，激活作用更显著提高; PatJAZ4通过与PatSWC4结合而抑制其转录激活功能，而施加MeJA则能逆转这种抑制作用。在广霍香叶片中瞬时过表达PatSWC4，能激活广霍香醇合成酶PatPTS和MVA途径PatFPPS等关键酶基因的表达;另外广霍香醇合成相关转录因子PatDREB、PatERFO61和3个PatMYC2的表达也显著提高，从而促进了叶片中广霍香醇的合成和积累。
(2) Y2H和Dual-1uc实验表明PatSWC4能分别与PatDREB、PatERF061形成转录复合体，复合体能激活PatPTS的启动子活性，外源MeJA能抑制其激活作用。PatJAZ4能分别与PatSWC4、PatDREB、PatERF061结合，抑制转录复合体的形成，从而抑制PatPTS启动子的活性，这种作用在施加MeJA后可消除，甚至逆转。将PatSWC4分别与PatDREB、Pa tERF061;在广霍香叶片中进行瞬时共过表达，也能显著促进广霍香醇的合成和积累。
3.4 Trihelix转录因子PatASIL2调控广霍香醇合成机制研究
3.5两个铸指蛋白可能调控广茬香醇的合成
综上所述，为挖掘鉴定广霍香醇生物合成的转录调控因子，本研究首先构建了广霍香的全长转录组和酵母杂交文库，根据转录组注释分离克隆了广霍香MYC2转录因子，并研究其在广霍香醇生物合成中的重要作用，以PatPTS的启动子为诱饵筛选并首次鉴定了6个特异性调控PatPTS基因表达进而参与调控广霍香醇生物合成的转录因子，并利用瞬时过表达对其功能进行验证分析。PatDREB、PatERFO61、PatSWC4和Pa tASJL2的基因表达和转录调控功能受外源MeJA诱导，可能为JA信号通路的下游响应转录因子。蛋白互作结果还表明两个DREB转录因子能够与MYB-like转录因子(PatSWC4、PatASJL2)形成转录复合体调控广霍香醇的合成。同时PatGATA17和PatGIS2作为调控广霍香醇合成的候选转录因子开展初步鉴定。本研究首次筛选获得多个转录因子，功能分析揭示了其调控广霍香醇生物合成的可能模型，不仅促进从转录调控上揭示广霍香醇的生物合成分子机制，在广霍香响应激素诱导的分子调控网络机理的解析取得突破，而且有助于广霍香及广霍香挥发油的质量控制，为利用代谢调控手段提高药用植物活性成分合成提供理论基础和应用借鉴。