相思树的细胞培养及体胚发生研究

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本试验以卷荚相思、台湾相思、黑木相思愈伤组织为试验材料,研究了不同培养条件对愈伤组织的保存及状态调控的影响;比较了3种相思树在悬浮细胞系在建立和保存上的差异性;从悬浮细胞中分离出3种相思的单细胞,并建立单细胞克隆体系;以黑木相思愈伤组织为试验材料,建立了黑木相思体胚发生体系,并进行了体胚发生过程的细胞学观察以及过氧化物酶活性及蛋白质含量的变化。主要研究结果如下:1.相思树愈伤组织继代保持体系的建立。试验比较了激素水平、光照条件、基因型等因素对3种相思树愈伤组织继代保持的影响。结果表明:培养基MS+0.2 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-1BA+0.2 mg·L-1NAA有利于愈伤组织的保持;最佳接种量为每瓶0.3 g愈伤组织。2.相思树愈伤组织状态调控和筛选。试验分析了不同2,4-D浓度对相思树愈伤组织状态的影响。结果表明:在2,4-D浓度为0.2~1 mg·L-1时,3种相思树愈伤均保持较好的状态,多为淡黄色,松软Ⅱ、Ⅲ型愈伤组织,适宜于悬浮细胞培养;光照比较试验发现,弱光有利于使愈伤组织保持松散状态。3.3种相思树悬浮细胞系的保持。试验分析了基因型、愈伤组织类型、2,4-D浓度、蔗糖浓度,起始接种量等各因素对悬浮细胞培养的影响。结果表明:选择淡黄色,质地鲜嫩松脆的愈伤组织作为相思悬浮培养的材料,能较快的建立起悬浮细胞系。黑木相思细胞小,胚性强,分散性好,最容易建立起悬浮细胞系。当蔗糖浓度为30 g·L-1,2,4-D浓度为0.2 mg·L-1时,适宜于悬浮细胞的保持。起始接种量对相思悬浮细胞系生长也有很大影响,从保持悬浮细胞系的角度看,适宜的接种量为每瓶0.5~1.0 g为宜。台湾相思悬浮细胞培养周期以7d继代1次,卷荚相思悬浮细胞培养周期以8-10 d为宜。4.相思树单细胞培养及分化。试验分析了细胞培养的初始密度、细胞培养方法、添加剂、细胞培养继代次数等因素对黑木相思、卷荚相思、台湾相思单细胞培养分化的条件影响。结果表明:卷荚相思和台湾相思细胞培养的最适植板密度为5×104~5×105个/mL,而黑木相思的细胞培养的最适植板密度为1×105~1×106个/mL。平板培养、悬浮培养、看护培养均可使黑木相思单细胞分化出愈伤组织,并伴有胚状体发生,而卷荚相思和台湾相思单细胞培养采取平板培养的方式更有利于单细胞分化愈伤组织。在培养基中添加水解酪蛋白有利于这3种相思单细胞培养。5.黑木相思体胚发生。试验比较了激素水平对黑木相思愈伤组织体胚诱导的影响。结果表明:在含一定浓度的BA的培养基中,黑木相思愈伤组织都能产生绿色胚状体;在MS培养基中,添加3 mg·L-1BA、0.5 mg·L-1IAA和0.5 mg·L-1NAA,愈伤组织的胚状体分生率最高能达到94%甚至以上,但诱导产生的多为畸形胚,成苗率不高。6.黑木相思体胚发生过程中组织细胞学观察及生理生化活性变化。应用石蜡切片技术对黑木相思体胚发生过程进行了组织细胞学观察。结果表明:黑木相思体胚发生有外起源和内起源两种,其过程经历了球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚阶段;在黑木相思愈伤组织胚状体发生过程中,POD活性和蛋白质含量都出现明显变化,POD活性出现了两个高峰期,分别是在培养10d左右的胚状体发生初期以及培养40d左右的胚状体成熟期。
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