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Cajal 间质细胞(interstitial cells of cajal,ICC)由诺贝尔医学奖得主 Santiago Cajal 最早在兔的肠神经系统中发现的一类特殊的间质细胞,目前研究表明,它主要功能有:自发性产生慢波;推进胃肠电活动的传播;参与神经信号传递,以及作为平滑肌的牵张感受器,其与胃肠道疾病密切相关。反刍动物具有瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃,其明显有别于哺乳动物的单室胃。Cajal间质细胞在单室胃哺乳动物广泛报道,但在山羊复胃中还未报道。因此本研究以山羊复胃为试验材料,通过免疫组化标记ICC的特异性标记物酪氨酸激酶c-kit,分析ICC光镜结构特点以及分布情况;利用RT-PCR,检测c-kit基因、其配体干细胞因子(stem cell factor,SCF)在山羊各个胃组织的表达情况;采用Western Blot,研究c-kit蛋白在山羊各个胃组织的表达情况。应用透射电镜观察瘤胃中ICC的超微结构特点;运用免疫组化标记波形蛋白Vimentin,探究瘤胃波形蛋白表达分布;通过免疫双标标记波形蛋白Vimentin和蛋白基因产物PGP9.5或者一氧化氮合酶nNOS以及免疫双染Vimentin和PGP9.5,研究瘤胃中ICC与神经的关系。结果将从细胞和分子水平阐明复胃动物ICC功能形态学,对揭示山羊胃肠道功能有着重要意义,为山羊复胃疾病预防和治疗提供科学依据。实验Ⅰ 山羊复胃中Cajal间质细胞鉴定与分布研究 本研究采用免疫组织化学法(IHC)的方法观察了山羊不同复胃的c-kit蛋白免疫阳性细胞的分布特点;利用实时荧光RT-PCR分析山羊不同复胃的c-kit基因以及SCF基因表达情况;应用免疫印迹Western Blot探究山羊不同复胃的c-kit蛋白表达差异。结果显示,c-kit蛋白免疫阳性细胞能够标记两种细胞。第一种阳性细胞为ICC,其形态表现为星形或双极形,带有数量不等的短突起。在皱胃中ICC分布于粘膜下层、肌间层,以及肌内层,且各层分布密度多;在瓣胃中ICC分布在粘膜下肌层和肌间层,肌内层,但肌内层分布较少;在瘤胃中ICC分布于上皮下层和肌内层;在网胃中分布在粘膜下层和肌内层。第二种阳性细胞为肥大细胞,形态表现为圆形;主要位于粘膜下和固有层。对于山羊不同的复胃c-kit基因和SCF基因分布有差异。C-kit基因在皱胃高表达;在瓣胃、瘤胃次之;网胃表达最低。SCF基因表现为皱胃表达最高,在网胃,瘤,瓣胃表达次之。C-kit蛋白表现为皱胃高表达,瘤胃、网胃、瓣胃差异不明显。这些结果表明,ICC在山羊复胃动力学机制中发挥着重要的调控作用。实验Ⅱ 山羊瘤胃中Cajal间质细胞的超微结构特点 本试验运用透射电镜探究山羊瘤胃中ICC的超微结构特点。结果显示,ICC胞体表现为纺锤形或星形,带数量不等的短突起。细胞核呈梭形或不规则形,核周边有大量的异染色质。细胞质中含有丰富的细胞器,包括有高尔基体复合体,线粒体,和粗面内质网,同时还发现有不连续的基底膜。在胞质中偶尔可见中间丝。同时可以经常发现细胞质膜上有数量不等的胞膜小凹分布。ICC与神经形成突触样的结构,同时与平滑肌细胞形成缝隙连接。根据分布位置的不同可分为三种亚型,一种位于环形肌与纵行肌之间的肌间神经丛内称为肌间ICC,第二种位于环形肌和纵行肌之内称为肌内ICC,最后一种位于粘膜下层被认为是粘膜下层ICC。山羊瘤胃的超微结构特点以及分布特征表明,ICC在山羊瘤胃反刍和消化加工机制中发挥着重要作用。实验Ⅲ 山羊瘤胃中波形蛋白分布研究 为了检测瘤胃波形蛋白的分布,我们应用了免疫组化标记波形蛋白Vimentin。结果显示在山羊瘤胃的不同部位均有Vimentin阳性细胞的存在,分布密度不等。Vimentin免疫阳性细胞的突起广泛分布在瘤胃乳头和上皮下区,这里的细胞主要为ICC。然而分布在瘤胃乳头下的ICC突起呈现双极性或梭形,在固有层中波形蛋白阳性细胞突起呈现成纤维细胞或ICC。在肌肉层中,Vimentin 阳性细胞分布在肌肉束之间的间质区域,这些细胞表现为星形带有少量的突起的神经胶质细胞或ICC。此外,Vimentin 阳性细胞显著分布在神经内膜处和围绕着神经束膜处的神经节以及神经元。以上结果表明,瘤胃中ICC、成纤维细胞、内皮细胞、神经胶质细胞广泛表达波形蛋白。它们之间建立广泛联系,形成网络支架,起到关键的生理功能,进一步为将来为治疗山羊瘤胃疾病提供理论基础。实验ⅢⅠ 山羊瘤胃中Cajal间质细胞与神经关系研究 采用ICC标记物之一波形蛋白(vimentin)和神经纤维特异标记物蛋白基因产物(PGP9.5),对瘤胃组织切片进行免疫细胞化学双标,观察山羊瘤胃中肌内ICC(ICC-IM)与神经纤维的关系;采用Vimentin和特异标记氮能神经的一氧化氮合酶nNOS,对瘤胃组织切片进行免疫细胞化学双标,观察山羊瘤胃中ICC-IM与抑制类神经纤维的关系;通过Vimentin和PGP9.5免疫组织化学双染,进一步探究瘤胃中ICC-IM与神经的关系。结果表明:PGP 9.5免疫反应PGP9.5-LI神经纤维与大部分ICC-IM有紧密接触,有少部分的ICC-IM远离PGP9.5-LI神经纤维。抑制类的nNOS免疫反应nNOS-LI神经与PGP9.5-LI神经纤维一样,nNOS-LI神经纤维与大部分ICC-IM有紧密接触,有少部分的ICC-IM远离PGP9.5-LI神经纤维。这些实验数据表明山羊瘤胃中ICC可能参与神经递质传递,从而介导平滑肌收缩。