背景肝细胞肝癌(HCC)是严重危害我国人民生命健康的恶性疾病。现阶段肝癌诊断、预后预测及疗效监测相关标志物非常有限,传统检测手段主要是基于影像学、病理学以及血清学的判断。这些手段存在特异性和灵敏度低,实时动态监测难实现,有创伤等缺陷。开发新型肝癌标志物是临床实践的迫切需求。由于线粒体DNA(mtDNA)基因组小,拷贝数多,突变率高以及与肝癌发生发展关系密切,其突变及拷贝数变异的精准检测作为新型肝癌标志物具有独特优势。近几年来,二代测序技术(NGS)已被广泛用于mtDNA测序。但有研究报道在mtDNA捕获测序中存在样本间交叉污染,mtDNA的检测准确性受到严重干扰。所以,清除交叉污染并建立mtDNA精准检测技术至关重要。此外,以循环肿瘤DNA(ctDNA)检测为代表的液体活检技术发展迅猛,也为游离线粒体DNA(cfmtDNA)相关标志物的开发提供了充分的技术保障和经验积累。目的1.建立交叉污染分析与清除流程,开发mtDNA精准检测技术;2.肝癌mtDNA突变的大样本检测及特征图谱研究,开发肝癌预后预测标志物;3.检测肝癌患者血浆游离mtDNA拷贝数,探索其作为肝癌诊断,预后预测及经动脉化疗栓塞(TACE)疗效监测标志物的可行性。方法第一部分:基于dual-barcode文库构建技术,完成240例DNA样本的mtDNA捕获测序。利用HemI 1.0-Heatmap illustrator绘制交叉污染的热图并系统分析不同Illumina测序平台和捕获方法对mtDNA测序的交叉污染水平的影响。通过比较污染过滤前后的mtDNA突变和haplogroup,分析交叉污染对mtDNA检测的干扰;第二部分:利用dual-barcode mtDNA测序技术,检测156例乙肝相关肝癌(HBV-HCC)患者癌和癌旁组织中的mtDNA体细胞突变,鉴定肝癌发生发展中的关键突变并结合预后信息进行Kaplan-Meier生存分析。在细胞实验中,探索关键突变的生物学功能及作用机制;第三部分:利用Picard分析血浆游离mtDNA(cfmtDNA)的片段大小分布以及含量特征。探索cfmtDNA拷贝数作为肝癌诊断,预后预测和TACE疗效监测标志物的可行性。结果第一部分:基于传统的single-barcode mtDNA测序数据中普遍存在不同程度的样本间交叉污染。在Hiseq 2500测序平台上,20例DNA样本的交叉污染水平为0.27%-11.90%,在Hiseq X Ten上为0.93%-17.70%,基于dual-barcode测序策略可以有效地消除这些交叉污染。此外,分析结果表明交叉污染主要来自捕获过程,并受到不同NGS平台的影响。Hiseq X Ten平台上测序来源的交叉污染水平显著高于Hiseq2500。捕获和测序来源的交叉污染水平均与测序深度呈显著负相关。分析结果显示交叉污染会导致mtDNA异质性突变检测出现大量假阳性结果,并干扰mtDNA突变的异质性水平检测。但是,交叉污染对mtDNA haplogroup分类影响较小。第二部分:在HBV-HCC患者的癌和癌旁组织中存在大量mtDNA突变,二者突变模式截然不同。尽管肝癌组织中D-loop区突变的平均数和重复频率低于癌旁组织,但异质性水平显著高于癌旁。这提示D-loop区突变在肝癌发生过程中受到正向选择。12例肝癌组织的多点取材测序结果进一步证实了这一推论。此外,Kaplan-Meier生存分析结果表明,肝癌组织中的D-loop区突变与mtDNA低拷贝数以及术后复发密切相关。我们在细胞实验中初步探索了D-loop区突变影响患者预后的机制:具有D-loop区突变的HCC细胞的增殖,侵袭和迁移能力明显高于没有D-loop区突变的。上述结果凸显了mtDNA D-loop区突变在HBV相关肝癌发生中的关键作用。第三部分:在肝炎和肝癌患者cfDNA全基因组测序数据中,比对到全基因组的reads的片段大小主要集中在160bp附近,而其中比对到线粒体基因组的reads的片段大小主要集中在70bp附近。这提示血浆游离mtDNA的片段化程度比核基因组更加严重。肝癌患者的血浆游离mtDNA拷贝数显著高于肝炎患者(6.98 vs.2.64,P=0.002)。血浆游离mtDNA拷贝数在肝癌诊断的ROC曲线下面积(AUC)高达0.843,初步提示了该项指标作为肝癌诊断标志物的潜能。此外,血浆游离mtDNA拷贝数高的肝癌患者总生存更差,也提示其可能是潜在的肝癌预后预测标志物。依据mRECIST标准,6例肝癌患者TACE治疗效果可以分类为1例患者治疗后部分缓解(PR),4例治疗后疾病稳定(SD)以及1例治疗后疾病进展(PD)。部分缓解的患者血浆游离mtDNA拷贝数从治疗前的8.38降至治疗后的6.30,疾病进展的患者浆游离mtDNA拷贝数从治疗前的12.83升至治疗后的35.80。总体来说,治疗前后血浆游离mtDNA拷贝数变化与影像学检测结果基本一致。结论基于dual-barcode的mtDNA测序策略能够有效地清除样本间交叉污染,为mtDNA的精准检测提供技术支撑。我们首次使用mtDNA二代测序技术系统全面地分析了HBV-HCC中的mtDNA突变,发现mtDNA D-loop区突变在肝癌发生中的关键作用,提示mtDNA D-loop突变可能成为预测HBV-HCC预后的潜在标志物。研究结果在小样本中初步证明了cfmtDNA拷贝数作为肝癌诊断,预后预测和疗效监测标志物的可行性。