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目的:确定促发吞咽活动的皮质吞咽区所在的位置以及具体的神经元类型。在此基础上,建立新型的皮质中风后吞咽障碍小鼠模型,评价电针廉泉穴对模型小鼠吞咽功能的改善作用。并进一步以损伤对侧皮质吞咽区的锥体神经元为切入点探讨电针廉泉穴的起效机制。方法:实验一:小鼠吞咽活动相关的皮质神经元所在位置、类型以及功能本部分的实验分三阶段进行。首先选用6周龄的雄性C57BL/6小鼠,常规手术麻醉后,进行颈部手术,暴露小鼠的颈前肌群,钝性分离二腹肌和下颌舌骨肌,通过微量注射泵连接自制的病毒注射针吸取PRV-CMV-EGFP病毒,将病毒注射入小鼠的下颌舌骨肌中,每只小鼠的注射量为3ul。按照不同的时间点对小鼠进行取材。运用免疫荧光技术检测病毒表达阳性的区域以及神经元类型。然后,开始进行第二阶段的实验。首先对C57BL/6小鼠进行开颅手术,调整颅骨平面,标记目标脑区上方的颅骨,颅骨钻钻孔,通过微量注射泵将AAV-CaMKⅡα-hChR2-mCherry病毒注射入目标脑区内,病毒注射结束后,埋置陶瓷插芯。小鼠常规恢复2周后,运用光遗传结合脑片膜片钳技术检测工具病毒的效率。最后,进行第三阶段实验。用光纤跳线连接光遗传刺激系统和小鼠头上的陶瓷插芯,将记录电极插入到小鼠的吞咽肌群,参比电极插入到咬肌中。设置不同的光刺激频率和强度,使用CED系列MICR01401Ⅱ信号采集装置和Spike2计算机信号分析系统实时采集光刺激诱发的肌电信号。实验二:中风后吞咽障碍小鼠模型的建立以及针刺廉泉穴的疗效评价本部分实验分两阶段进行。首先选用20周龄的雄性C57BL/6小鼠,随机分为Con组,M1-Isc组,Laser组,RB组和PFC-Isc组。Con组小鼠不予任何处理。M1-Isc小鼠在注射了玫瑰红B溶液后,使用激光器照射M1区制造缺血灶;Laser组小鼠不予注射玫瑰红B溶液,只采用激光器照射M1区;RB组小鼠之注射玫瑰红B溶液,不予激光照射;PFC-Isc组小鼠在注射了玫瑰红B溶液后,使用激光器照射PFC区制造缺血灶。造模完成后,先用激光散斑成像仪检测脑血流灌注量。然后检测小鼠4min的饮水量。紧接着将小鼠麻醉,用耳夹将小鼠固定于适配器上,将小鼠翻转过来呈仰卧位,用立体定位仪将一根塑料软管从小鼠的一侧嘴角插入到小鼠的后咽部,塑料软管的另一端与微量注射器和微量注射泵相连。将肌电记录线和地线与采集仪器接好,通过微量注射器将纯水注射到小鼠后咽部,实时采集给水诱发的肌电信号。然后进行第二阶段实验。选用20周龄的雄性C57BL/6小鼠,随机分为Normal、Isc、Isc+EA和Isc+sham EA组。Normal组小鼠不予任何处理;Isc组小鼠在注射了玫瑰红B溶液后,使用激光器照射M1区制造缺血灶;Isc+EA组小鼠注射了玫瑰红B溶液后,使用激光器照射M1区制造缺血灶,在实验后的1小时接受电针廉泉穴治疗。电针参数为1mA,2Hz,15min。Isc+sham EA组小鼠注射了玫瑰红B溶液后,使用激光器照射M1区制造缺血灶,然后接受假电针治疗。假电针只将针灸针换成牙签,其余操作同真针灸。所有小鼠在造模手术前禁水不禁食12小时,造模手术后同样禁水不禁食12小时。然后进行饮水实验和给水诱发肌电信号检测。实验三:电针廉泉穴对单侧皮质中风后吞咽障碍模型小鼠对侧皮质吞咽区的锥体神经元的激活作用本部分实验分三阶段进行。首先选用20周龄的雄性C57BL/6小鼠,随机分为Isc、Isc+EA和Isc+sham EA组。Isc组小鼠造模后2小时取材,Isc+EA和Isc+sham EA组小鼠在造模后1小时接受电针或假电针干预,干预结束后50分钟取材。运用免疫荧光技术检测损伤对侧皮质吞咽区神经元的c-Fos蛋白表达水平。然后进行第二阶段实验。选用20周龄的雄性C57BL/6小鼠和GAD67-GFP小鼠。采用脑立体定位注射技术将AAV-CaMKⅡα-mCherry注射进C57BL/6小鼠的左侧目标脑区,病毒注射后小鼠常规恢复两周。然后,将C57BL/6小鼠随机分为Isc组和Isc+EA组,同样,将GAD67小鼠随机分为Isc组和Isc+EA组.运用免疫荧光技术检测损伤对侧皮质吞咽区特定类型神经元与c-Fos表达阳性神经元的共标情况。最后进行第三阶段实验,选用20周龄的雄性C57BL/6小鼠,随机分为EA（CV23）-M1组、EA（CV23）-PFC 组、sham EA（CV23）-M1 组。EA（CV23）-M1 组小鼠与 sham EA（CV23）-M1组小鼠的病毒注射和陶瓷插芯埋置位点均在左侧M1区。EA（CV23）-PFC组小鼠的病毒注射和陶瓷插芯埋置位点均在左侧PFC区。三组小鼠右侧的陶瓷插芯均埋置在M1区。注射的病毒为AAV-CaMKⅡ α-Gcamp6s。小鼠术后常规恢复两周。然后,我们先用光化学法损伤三组小鼠右侧的皮质吞咽区。1小时后,我们用光纤跳线连接光纤记录系统和小鼠头上的陶瓷插芯。EA（CV23）-M1组和EA（CV23）-PFC组小鼠,采用针灸针电针廉泉穴,而sham EA（CV23）-M1小鼠采用牙签进行假电针,用光纤记录系统实时记录针刺前5分钟,针刺15分钟和针刺后30分钟目标脑区的钙信号。实验四:抑制针刺对损伤对侧皮质吞咽区锥体细胞的激活,观察针刺的治疗效应本实验分两阶段进行。首先选用20周龄的雄性C57BL/6小鼠,随机分为两组,分别接受AAV-CaMKⅡα-hM4Di-mCherry 或者 AAV-CaMKⅡα-mCherry 病毒注射,病毒注射区域为左侧M1区。术后小鼠常规恢复两周。两周后,运用光化学法损伤两组小鼠的右侧皮质吞咽区。再将接受了AAV-CaMKⅡα-hM4Di-mCherry或AAV-CaMKⅡα-mCherry病毒注射的小鼠随机分为Isc组和Isc+EA组,每组小鼠均在针刺前35分钟腹腔注射CN0。运用免疫荧光技术检测这几组小鼠的c-Fos蛋白表达水平。然后,进行下一阶段的实验。选用20周龄的雄性C57BL/6小鼠。随机分为Normal、hM4Di+CNO、hM4Di+Isc+EA+CNO、hM4Di+Isc+EA、mCherry+Isc+EA+CNO 组。Normal组小鼠正常喂养,不予任何干预。hM4Di+CNO组小鼠只接受AAV-CaMKⅡα-hM4Di-mCherry 和 CN0 注射;hM4Di+Isc+EA+CNO 组小鼠先注射AAV-CaMKⅡα-hM4Di-mCherry,病毒充分表达后,常规光化学法造模,针刺前35分钟给予CNO再接受针刺治疗;hM4Di+Isc+EA组小鼠针刺前不予CNO,其余处理同hM4Di+Isc+EA+CNO组;mCherry+Isc+EA+CNO组小鼠注射的病毒是AAV-CaMKⅡα-mCherry,其余处理同hM4Di+Isc+EA+CNO组。最后,对各组小鼠进行饮水实验和给水诱发肌电信号检测。结果:1.小鼠吞咽活动相关的皮质坐标为AP:-0.16,ML:1.01,DV:-1,神经元类型可以判断为锥体神经元。免疫荧光结果显示目标脑区的神经元病毒表达量高,光遗传结合脑片膜片钳结果显示被病毒感染的细胞对蓝光刺激响应迅速且稳定。光遗传结合肌电记录的结果显示光刺激可以诱发吞咽肌群的明显反应。其中最佳的刺激参数为8mW,50Hz。2.运用光化学法造模后,激光散斑成像的结果显示Isc组小鼠损伤侧的血流灌注量明显低于健侧,差异具有统计学意义（P<0.01）。饮水实验的统计结果显示M1-Isc组小鼠的饮水量明显少于Con组（P<0.01）、Laser组（P<0.05）、RB组（P<0.05）和PFC-Isc组（P<0.05）。肌电检测的统计结果显示M1-Isc组小鼠的肌电信号曲线下面积明显小于Con组（P<0.01）、Laser组（P<0.05）,RB组（P<0.05）和PFC-Isc组（P<0.05）。而对于第二阶段的实验,饮水实验的统计结果显示Isc+EA组小鼠的饮水量明显多于Isc组,差异有统计学意义（P<0.05）。肌电检测的统计结果显示Isc+EA组小鼠的肌电信号曲线下面积明显大于Isc组（P<0.01）和 Isc+sham EA 组（P<0.05）。3.免疫荧光的统计结果显示,Isc+EA组小鼠损伤对侧皮质吞咽区c-Fos蛋白表达阳性的神经元数量明显多于Isc组和Isc+sham EA组（P<0.05）。Isc-EA组小鼠损伤对侧皮质吞咽区的c-Fos蛋白表达阳性的锥体神经元与总的锥体神经元之间的比值大于Isc组,差异具有统计学意义（P<0.05）。Isc-EA组小鼠损伤对侧皮质吞咽区的c-Fos蛋白表达阳性的中间神经元与总的中间神经元之间的比值没有统计学意义。光纤记录钙成像的结果显示,损伤对侧皮质吞咽区和前额叶皮质的锥体细胞钙信号在针刺过程中明显增加。而假电针对损伤对侧皮质吞咽区锥体细胞的钙信号没有明显影响。4.免疫荧光结果显示,对于接受AAV-CaMKⅡα-hM4Di-mCherry病毒注射的小鼠,Isc组和Isc+EA组小鼠的hM4Di 阳性细胞中c-Fos表达率的差异不具有统计学意义（P>0.05）;对于接受AAV-CaMKⅡα-mCherry病毒注射的小鼠,Isc+EA组小鼠的mCherry阳性细胞中c-Fos表达率明显多于Isc组,两组的差异具有统计学意义（P>0.05）。对于第二阶段的实验,饮水实验的统计结果显示hM4Di+Isc+EA+CNO组小鼠的饮水量明显少于hM4Di+Isc+EA组（P<0.01）和mCherry+Isc+EA+CNO组（P<0.01）。肌电检测的统计结果显示hM4Di+Isc+EA+CNO组小鼠的肌电信号曲线下面积明显小于 hM4Di+Isc+EA 组（P<0.01）和 mCherry+Isc+EA+CNO 组（P<0.01）。结论:1.皮质吞咽区的锥体神经元是参与促发吞咽活动的关键神经元。2.运用光化学法局限性的损伤皮质吞咽区可以建立可靠的皮质中风后吞咽障碍小鼠模型,而电针廉泉穴可以有效地改善模型小鼠的吞咽功能。3.电针廉泉穴可以有效地激活皮质吞咽区锥体神经元。4.电针廉泉穴使损伤对侧皮质吞咽区的锥体神经元激活从而代偿受损脑区的功能,这是针刺治疗皮质中风后吞咽障碍的关键中枢机制。