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氯霉素(chloramphenicol, CAP)是一种广谱抗生素,对人体有较强的副作用与毒性,会导致再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症,但因其价格便宜且性质稳定,养殖业中仍有违规使用的现象。化学发光酶免疫分析法(CLEIA)具有灵敏度高、线性范围宽等优点。本研究制备了抗CAP单克隆抗体,并建立氯霉素化学发光酶免疫分析方法。以琥珀氯霉素(HAP)和氯霉素为半抗原,牛血清白蛋白(BSA)为载体,分别采用混合酸酐法和重氮化法合成氯霉素免疫抗原HAP-BSA、CAP-BSA,起始摩尔比分别为50：1、30：1、20：1。以卵清蛋白(OVA)为载体,采用活泼酯法(EDC-NHS法)合成40：1-1：1七个不同起始摩尔比的ELISA检测用包被抗原(HAP-OVA),紫外、红外光谱扫描和SDS-PAGE电泳法鉴定全抗原偶联成功,紫外测定HAP-BSA偶联分别为27：1、18：1、8：1,CAP-BSA偶联比分别为21：1、11:1、5:1, HAP-OVA偶联比26：1-1：3。将偶联比为18：1的HAP-BSA,偶联比为21：1的CAP-BSA各免疫6只Balb/c小鼠,每种抗原三个剂量梯度25、75、100μμg／只,两个平行。三免后以4#HAP-OVA包被酶标板,ELISA法检测免疫血清效价及其对CAP的敏感性(通过CAP半数抑制浓度IC50值反映),最终选择效价高、IC50值低的6#小鼠冲击免疫。利用杂交瘤技术将6#小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,融合率为84.6%。经过亚克隆筛选出两株产抗CAP单克隆抗体的细胞株,编号为Ⅳ1B3、IV2E7,经扩大培养,用ELISA法检测上清液中抗体效价与敏感性,选择效价高、IC50值低的Ⅳ1B3株细胞注射小鼠腹腔,诱生腹水。辛酸-饱和硫酸铵法进行单克隆抗体纯化。通过优化选择偶联比为3：1的HAP-OVA为最佳包被抗原,此包被抗原下进行ELISA实验测定单克隆抗体效价为2×105,IC50值为15ng/mL。经鉴定,抗CAP单抗与青霉素、庆大霉素、链霉素、四环素药物几乎没有交叉反应,与琥珀氯霉素的交叉反应率为110.3%。采用混合酸酐法合成不同起始摩尔比的酶标记抗原HAP-HRP, ELISA实验选出最佳酶标记抗原。通过单因素实验确定了化学发光底物液各组分的最佳浓度,发光物质为5×10-4mol/L luminol,发光增强剂为4×10-4mol/L对碘苯酚,氧化剂为3×10-3mol/L H2O2溶液。通过直接竞争CLISA实验优化,确定了单克隆抗体包被浓度为1.5μg/mL, HAP-HRP稀释倍数为1000倍,标准品CAP(待测物)与HAP-HRP竞争时间为30min。建立了氯霉素CLEIA分析方法,标准曲线为Y=-130801gX+35091,线性相关系数r=0.997(其中Y为RLU值,1gX为CAP对数浓度),该方法中CAP半数抑制浓度IC50为2.3ng/mL,检测限为0.018ng/mL,检测范围为0.067ng/mL-36.7ng/mL,批内标准偏差<7%，.批间标准偏差<10%,基围虾的加样回收率在96%-112%该方法重现性和精密度良好。本方法可以为氯霉素化学发光试剂盒提供基础。