研究背景我国血脂异常患病率呈现急剧增加的趋势,血脂代谢紊乱与糖尿病、高血压、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化等的发生机制密切相关。脂代谢紊乱引起的高血脂、脂毒性会引起免疫炎症异常,而后者又会进一步促进脂代谢紊乱。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)作为血脂代谢紊乱的主要血管并发症,血液中脂质等物质沉积,并伴随内膜受损、炎症细胞及因子积聚等一系列病变,最终因脂质条纹或斑块等的形成,导致管腔形态的病变等。AS也是脂代谢紊乱与免疫炎症相互促进的典型代表,血脂异常是其发病的关键因素。T、B淋巴细胞是免疫反应的主要细胞成分,分别介导细胞免疫和体液免疫,它们在免疫炎症中发挥着重要的作用,起着执行者以及调控者的作用,T、B淋巴细胞在脂代谢紊乱造成的免疫炎症中发挥着重要作用,与AS的发生发展等密切相关。尽管大量的临床及基础研究证实在AS的不同阶段存在有不同亚型的T细胞以发挥不同功能的形式参与了疾病的进程,不同的B细胞业群对AS也具有不同的作用,但就目前而言,T细胞和B细胞在AS中发挥作用的具体机制仍未完全阐明,尤其是T细胞免疫反应如何在AS中启动并调控这一精确的机制、B细胞如何影响AS、B-2 B细胞是否通过分泌免疫球蛋G(Immunoglobulin G,IgG)来影响AS等仍然了解很少,而这一启动和调控过程中所涉及的T细胞和B细胞亚群越多,机制就越复杂。造成这一复杂现象的原因可能是T细胞和B细胞亚群的多样性以及T细胞(抗原)受体(Tcellreceptor,TCR)和B细胞(抗原)受体(B cell receptor,BCR)区域的多变性。因此,研究AS斑块中T细胞和B细胞免疫组库可以进一步揭示其在动脉硬化中的发病机制。免疫组库(Immune repertoire,IR)是任何给定时间内,个体循环系统中具有功能多样性的T细胞克隆和B细胞克隆总和。当发生某种特异性免疫应答时,T细胞和B细胞免疫组库多样性降低,出现单一、寡或多克隆数的升高。以高通量测序为研究手段的免疫组库测序(Immune repertoire sequencing,IR-SEQ)为研究免疫组库的多样性和可变性提供了可能。下一代测序(Next generation sequencing,NGS)较高的灵敏度、特异性以及准确性也为免疫组库研究提供了更高的可靠性。本研究将有助于深入理解T细胞和B细胞在动脉粥样硬化性疾病中的作用,为揭示AS中炎症免疫异常的机制提供更有力的实验依据。目的研究动脉粥样硬化患者斑块与正常人外周血T细胞免疫组库和B细胞免疫组库中包括克隆频率、互补决定区3(Complementarity determining regions 3,CDR3)功能区氨基酸长度、公共克隆的分布特征以及V/D/J基因利用率等的变化,从而在DNA单碱基水平上揭示AS患者斑块内细胞克隆的组成和变化,为研究AS发病机制提供更为详细的证据。方法1收取正常对照组外周血56例,纳入标准为临床表现为无典型心绞痛和心电图改变的正常受试人员,年龄均≥40岁。正常人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)利用密度梯度离心法提取。AS斑块组织样品4例,取自尸检标本和具有AS特征的斑块标本。2天根基因组提取试剂盒,利用离心柱法提取外周血单个核细胞以及组织样品基因组DNA。每组gDNA提取后,各取等量gDNA混合在一起,形成正常组外周血组样品池和AS斑块组样本池。3根据所测DNA浓度及质量计算最适DNA样品取用量。加入正、反引物,QIAGEN multiplex PCR Kit 进行多重 PCR 用于捕获 CDR3 区域。QIAquick PCR Purification Kit对PCR产物进行纯化,而后在经过末端修复、接头连接等建库步骤,完成文库的构建。最后通过检测插入片段范围和浓度定量的方法对构建好的文库进行评估。4上一步检验合格的文库,预算上机的数据量,按比例稀释到预定的浓度。将稀释好的DNA文库加入到Flowcell内,进行桥式PCR扩增,然后测序。5分析软件miXCR将过滤后的原始数据进行序列比对,分析不同CDR3序列以及这类数据提供的克隆表达情况,同时鉴定出包括CDR3区域的氨基酸序列及相对应的克隆读数,以及V/D/J基因数目和频率。此外,自写脚本和Microsoft Excel 2010软件分析频率区间分布、累积频率分布以及V/D/J基因利用率等。6将实验所得到的数据进行统计分析,使用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism 5数据分析软件。采用平均值±SEM,在后期的数据统计比较中,我们采用双尾t检验。P<0.05被认为具有统计学意义。实验结果1T细胞克隆频率比较与对照组健康受试者外周血内前100位克隆频率相比,动脉粥样硬化斑块中的前100位克隆频率明显升高。对两组样本池分析发现,在克隆相对低频区间内,健康受试者外周血在对应的区间内特异性克隆数目明显高于AS斑块组。在高频区间内(0.006-0.04)AS斑块组的特异克隆数目要比健康受试者明显增多。独立样本累积频率有类似的结果。2T细胞克隆长度分析健康受试者和AS斑块组的单个样品中,T细胞克隆氨基酸长度分布差异不显著,总体分布趋于一致,14、15氨基酸长度的CDR3序列最多,约占50%。3共同T细胞克隆比例分布分析与健康受试者的外周血相比,动脉粥样斑块中的共同克隆或称公共克隆(两个以上受试者都存在的克隆)比例明显升高,平均比例为0.38,而健康受试者平均比例约为0.23。对两组的3个受试者的共同的克隆进行统计分析发现,特异克隆中的共同克隆的比例在斑块组明显高于健康受试者组,相应的在所有克隆中的公共克隆的比例也是在斑块组明显升高。4V基因和J基因利用率分析斑块T细胞库中某些的V基因、J基因利用率明显高于健康受试者组,比如TRBV20-1,TRBJ2-5,TRBJ2-1。推测可能有共同抗原或病理刺激。5B细胞克隆频率比较与健康受试者外周血的前100位B细胞克隆频率相比,AS斑块的前100位克隆频率明显升高,>0.1%频率区间内AS斑块组B细胞克隆数比例高于健康受试者外周血组。6 B细胞受体CDR3区克隆长度分布动脉粥样斑块组相对于健康受试者组,动脉粥样斑块组中某些长度如(15、16、17、18和20)个氨基酸的B细胞克隆频率高于健康受试者组。7分析B细胞克隆VJ基因利用率斑块B细胞库中的V-J基因利用率(V-J基因类型)与健康受试者组相比减少,但是B细胞高频克隆增加,比如V3-21-J4,V3-23-J4。在斑块BCR库中某些的V基因和J基因利用率明显不同于健康受试者外周血(NPB),比如:IGHV3-21,IGHV3-23,IGHV3-33,IGHJ4。结论1.与健康受试者相比,AS患者斑块内T细胞和B细胞高频克隆数增加。2.与健康受试者相比,AS斑块组的T细胞共同克隆比例升高。3.AS斑块与正常受试者相比,编码某些特异T/B细胞克隆的V、J基因的利用率升高。