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背景:成纤维细胞是心脏内的重要细胞组成成分,成纤维细胞的功能变化与心肌细胞联系紧密,直接影响到心肌的的发育、肥大、机械和电学的活动。心脏成纤维细胞的表型转化（fibroblast myofibroblast transition,FMT）与心肌炎症、心肌肥大以及心肌梗死预后密切相关。在外界刺激下,成纤维细胞增殖、分化,分泌大量的细胞外基质（extra-cellular matrix proteins,ECM）,从而引起心脏纤维化,发生纤维化重构,诱发心律失常以及降低心脏功能。近年来发现钠/钙交换蛋白（Sodium/calcium exchange protein,NCX）、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（Calcium/calmodulin dependent protein kinase II,CaMKII）是重要的介导FMT的信号分子,其中CaMKII直接介导了血管紧张素II（Angiotensin II,AngⅡ）诱导的FMT。本课题组前期已经证实心外膜高表达血管紧张素转化酶2（Angiotensin converting enzyme 2,ACE2）可以增加心房肌中血管紧张素-（1-7）（Angiotensin-（1-7）,Ang-（1-7））表达,从而逆转心房快速起搏模型中的心房纤维化重构,降低房颤的发生率及持续时间,证实了Ang-（1-7）的抗离子通道重构和抗纤维化功效。Ang-（1-7）是重要的拮抗AngⅡ的肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS）中具有生物学活性的终末产物,Ang-（1-7）生理功能往往与内皮型一氧化氮合酶（endothelial Nitric oxide synthase,eNOS）、一氧化氮（nitric oxide,NO）联系,同时具有抗成纤维细胞增殖、抗心脏纤维化的作用。目的:探讨Ang-（1-7）的抗FMT的效应与AngⅡ激活的Ca2+和CaMKII的关系,进一步明确NCX1在AngⅡ诱导的Ca2+紊乱中的作用。方法:实验分为三个部分:第一部分为体外培养原代心脏成纤维细胞,细胞分组为对照组,AngⅡ组,AngⅡ+KB-R7943（NCX1抑制剂）组,AngⅡ+CaMKII抑制剂（Autocamtide 2-related inhibitory peptide,AIP）,AngⅡ+Ang-（1-7）组,AngⅡ+Ang-（1-7）+eNOS抑制剂（Nω-Nitro-Larginine methyl ester hydrochloride,L-NAME）组。免疫荧光检测成纤维细胞的增殖及表型转化情况;Western blot检测NCX1、CaMKII、磷酸化CaMKII（Thr 287）（Phosphorylated CaMKII,p-CaMKII）、氧化型CaMKII（Met281/282）（Oxidized-CaMKII,ox-CaMKII）、转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1）及表型转化相关指标;Fluo 4-AM荧光探针实时监测成纤维细胞中Ca2+变化。第二部分为动物实验:成年Sprague-Dawley大鼠（SD）分为对照组,AngⅡ组,AngⅡ+AIP（CaMKII抑制剂）组,AngⅡ+Ang-（1-7）组,AngⅡ+Ang-（1-7）+L-NAME组。苏木素/伊红（Hematoxylin/eosin,HE）及天狼星染色观察心脏结构和纤维化情况;二氢乙啶（Dihydroethidium,,DHE）探针检测心肌内氧自由基（reactive oxygen species,ROS）水平;Western blot检测CaMKII相关、平滑肌肌动蛋白（Alpha smooth muscle Actin,α-SMA）、eNOS蛋白表达;组织化学观察α-SMA、TGF-β1、ox-CaMKII及I型胶原蛋白（Collagen I,Col I）的表达;组织荧光双标检测α-SMA和ox-CaMKII的表达和定位,明确组织中成纤维细胞ox-CaMKII的表达。第三部分为细胞+动物实验:分组为对照组,AngⅡ组,AngⅡ+AIP（CaMKII抑制剂）组,AngⅡ+Ang-（1-7）组,探讨缝隙连接蛋白43（Connexin 43,Cx43）在AngⅡ激活的CaMKII通路中对FMT的作用。动物试验中HE及天狼星染色观察心脏结构和纤维化情况;DHE探针检测心肌内ROS水平;Western blot检测CaMKII相关、Cx43、α-SMA蛋白表达;组织化学观察Cx43、α-SMA、TGF-β1;免疫荧光双标检测组织切片上标记α-SMA和Cx43表达,明确成纤维细胞中Cx43表达情况。细胞试验中免疫荧光检测AngⅡ不同处理时间下的Cx43和α-SMA相对表达变化;Western blot检测α-SMA,TGF-β1,Cx43表达;TGF-β1 si-RNA转染后用Western blot及免疫荧光观察α-SMA、Cx43表达;免疫荧光双标分别在成纤维细胞上标记α-SMA和Cx43表达,明确成纤维细胞中Cx43表达情况。结果:第一部分:与对照组相比,AngⅡ可促进成纤维细胞的增殖及ROS生成,促进FMT,Western blot、免疫荧光均提示α-SMA表达增加（P<0.05）,AngⅡ促进NCX1表达及CaMKII的激活伴随p-CaMKII、ox-CaMKII高表达（P<0.05）;与AngⅡ组比较,AIP及Ang-（1-7）预处理可以有效地降低上述指标的变化,抑制FMT;与AngⅡ+Ang-（1-7）组比较,L-NAME抑制eNOS活性可以促进FMT,其效应与AngⅡ相似。细胞内钙离子检测提示:AngⅡ促进钙库操作性钙离子通道（store-operated calcium channel,SOCC）介导的Ca2+内流（store-operated calcium entry,SOCE）,并且NCX参与到了这一过程之中;而Ang-（1-7）长时间预处理可以降低AngⅡ诱导的Ca2+入胞,细胞内的Ca2+浓度降低;第二部分:与对照组相比,心脏病理染色发现AngⅡ可促进心肌肥厚,间质纤维化以及ROS水平,增加α-SMA、Col I、ox-CAMKII、TGF-β1表达;Western blot检测发现p-CaMKII、ox-CaMKII、NCX1表达增高;免疫荧光双标结果显示ox-CAMKII在α-SMA阳性区域内表达增加。与AngⅡ组比较,AIP及Ang-（1-7）预处理可以有效地降低上述指标的变化;与AngⅡ+Ang-（1-7）组比较,抑制eNOS活性可逆转由Ang-（1-7）介导的对AngⅡ诱导的FMT的抑制效应,结果与AngⅡ处理组相似,ox-CAMKII在α-SMA阳性区域内表达增加。第三部分:动物实验结果显示:AngⅡ可降低心肌内Cx43的表达,伴随CaMKII的激活及TGF-β1的高表达;冰冻切片免疫荧光双标提示α-SMA高表达。在α-SMA阳性区域中,Cx43表达降低,心肌细胞与成纤维细胞之间的细胞连接减少,而AIP及Ang-（1-7）预处理可抑制上述效应,Cx43的表达增加。细胞试验中,随着AngⅡ处理时间的延长,成纤维细胞中α-SMA及Cx43表达逐步增加,Cx43上升的时间早于α-SMA。当成纤维细胞转化为肌成纤维细胞时,Cx43表达快速下降;与AngⅡ比较,TGF-β1 si-RNA转染可以抑制AngⅡ诱导的Cx43、α-SMA表达增加;AIP及Ang-（1-7）预处理可以降低Cx43、TGF-β1的表达及CaMKII激活。结论本研究主要发现:（1）AngⅡ可以通过NCX增加成纤维细胞中的Ca2+浓度,激活CaMKII,引起p-CaMKII、TGF-β1表达增加,促进FMT过程;（2）同时,AngⅡ可以诱导细胞内的ROS生成增多,ROS可以来源于eNOS解聚及NOX2及NOX4,促使ox-CaMKII表达增加,进一步激活CaMKII;（3）Ang-（1-7）的抗纤维化的效应与其通过抑制NCX活性、降低跨膜转运Ca2+相关,细胞内低Ca2+浓度及抗氧化作用同时降低了CaMKII激活,抑制了TGF-β1的表达,减轻了心脏纤维化重构;（4）Cx43同时也参与了CaMKII/TGF-β1通路介导的FMT;（5）Ang-（1-7）通过对CaMKII活性的抑制,降低了TGF-β1、Cx43促纤维化相关信号分子的表达,减轻了心脏纤维化重构。总之,Ang-（1-7）可通过调节NCX缓解AngⅡ诱导的成纤维细胞钙离子调节紊乱,通过降低过度激活的CaMKII,减少TGF-β1、Cx43促纤维化相关信号分子的表达,抑制了FMT及心脏中胶原的沉积,有效的维持了正常的心脏机械和电学的活动。