背景和目的创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury TBI)系作用力直接或间接作用于头部引起的脑组织损伤,是复杂且严重的中枢神经损伤。随着当今社会发展,社会活动的不断增加,颅脑损伤案件频发。主要为交通事故伤、建筑工地伤、高坠伤、中老年摔伤等。TBI的发病机制比较复杂,它是由原发性损伤和继发性损伤共同作用的结果。目前在临床上对于TBI损伤机制以及治疗预后的研究上有一定进展,也可以根据CT、MRI对TBI进行伤情判断。在法医学中,对于TBI的研究的重点和难点是确定损伤时间。传统上,判定损伤时间主要依据TBI后的病理形态行为及改变,但此方法主观性太强,对损伤时间的判断也不够精确。随着分子生物学技术的不断提高,通过生物标记物的检测确定损伤时间成为法医学研究的重点。星形胶质细胞在中枢神经损伤中起着至关重要的作用,其中GFAP、S100B都是星形胶质细胞中的特异性标记物,也参与脑损伤后的免疫反应、修复等。本实验通过建立颅脑损伤模型,应用免疫组织化学染色方法、荧光定量PCR技术、Western blot技术,检测损伤后不同时间内GFAP、S100B的表达变化以及与损伤时间的关系。拟为法医检案实践中颅脑损伤时间的推断提供理论依据。方法SPF级健康的SD(Sprague Dawley,SD)大鼠110只,雌雄不限,体重250g-300g,购自郑州大学医学院实验动物中心[许可证号:SCXK(豫)2015-0004编号:NO.41003100004232]。单独笼养于郑州大学基础医学院法医实验室动物房,适应性喂养两周。按照实验需要将所有大鼠随机分为对照组(20只)和实验组(90只),实验组动物按照不同损伤时间分为3h、6h、12h、1d、3d、7d。实验过程中出现颅骨骨折或死亡未计入实验组。采用Feeney大鼠脑损伤打击装置并进行改造制备大鼠闭合性脑损伤模型;对照组大鼠除不采取打击操作,其他与实验组相同。将对照组和实验组已制备好的大鼠模型分为免疫组化染色组、荧光定量PCR组、Western Blot组分别测定GFAP、S100B的阳性细胞表达、mRNA表达以及蛋白表达量。(1)免疫组织化学染色组动物处理流程如下:用多聚甲醛固定脑组织(经心脏灌流操作),石蜡包埋切片,染色。HE染色观察大鼠脑皮质的形态学改变、观察实验组与对照组形态变化的不同,免疫组织化学染色检测GFAP、S100B阳性细胞表达率;(2)荧光定量PCR组:取损伤灶及周围5mm内脑组织(50g),编号存管,放于液氮保存,测定mRNA时,先提取总RNA然后反转录成cDNA最后测定GFAP-mRNA及S100B-mRNA表达量;(3)Western blot组:取脑组织标本同PCR组,提取组织蛋白、测定蛋白浓度、SDS-PAGE电泳、进行转膜、一抗孵育、二抗孵育、曝光、显色。结果1.行为学观察结果:与对照组比较,实验组大鼠部分反射消失,出现去皮质综合症,呼吸浅快,甚至暂停;2.脑组织标本及含水量结果:实验组大鼠,损伤灶及周围出现挫伤、出血、水肿;受损伤侧脑组织与对侧脑组织大小不均;脑组织含水量随损伤时间的变化而变化。大鼠脑损伤3h脑含水量逐渐增加,1d时达到高峰,此后开始下降。各组脑损伤后脑组织含水量与对照组比较均有统计学意义(ρ<0.05);3.大鼠脑组织皮质区HE染色结果:3h开始可见细胞结构模糊不清;局限性出血、肿胀、体积增大;细胞周围间隙增大;胶质细胞不断增生;损伤3d开始逐渐恢复,损伤7d可发现基本恢复正常,但与对照组仍有差别;4.免疫组织化学染色结果:TBI后GFAP、S100B阳性表达率均在3h时增高,1d达到高峰,3d后开始下降,7d仍高于对照。差异具有统计学意义(ρ<0.05);5.荧光定量PCR结果:TBI后,GFAP mRNA、S100B mRNA表达在3h时开始增高,3h-1d持续增高,1d到最高峰,3d开始下降,7d仍高于对照组。差异具有统计学意义(ρ<0.05);6.Western blot结果:TBI后,GFAP、S100B蛋白表达量在3h时开始增高,1d到最高峰,随后开始下降,7d仍高于对照组。差异具有统计学意义(ρ<0.05)。结论1.本实验中改进后的自由落体打击装置,由于制作简易、操作方便、实验动物死亡率低,能够重复稳定操作,使其对探索大鼠脑损伤实验研究有实用性价值。2.大鼠颅脑损伤后GFAP、S100B的表达变化,可为临床中颅脑损伤的精准诊断提供依据。3.大鼠颅脑损伤后,GFAP、S100B两者随损伤时间呈规律性分布,且有相似的表达趋势,两者拟可为法医检案中颅脑损伤时间的推断提供依据。