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目的:本研究旨在通过观察分析序贯使用补肾调经Ⅱ号方、Ⅲ号方对卵丘扩展分级情况、卵丘扩展相关因子、FSH及MAPKs信号通路的影响,揭示补肾法改善卵丘细胞外基质、促进卵丘扩展、卵母细胞发育成熟的作用及其机制,丰富中医“肾主生殖”的理论。方法:将360只动情周期正常的雌性昆明小鼠采用随机数表法随机分为正常组、对照组、补肾组,每组各120只。对照组与补肾组第1-9天腹腔注射Gn RHa,第9天同时注射PMSG,48 h后注射h CG,正常组注射等体积生理盐水,补肾组第1-9天灌胃补肾调经Ⅱ号方,第10-11天灌胃补肾调经Ⅲ号方,正常组与对照组灌胃等体积蒸馏水,连续11天。各组小鼠分别于注射生理盐水或h CG后6 h、9 h、12 h时,断头取血,离心,取血清;在显微镜下观察COCs的卵丘扩展分级并计数,然后收集COCs。放射免疫法检测小鼠血清FSH含量;实时荧光定量PCR法检测小鼠COCs中卵丘扩展相关因子HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2 m RNA的表达水平;免疫荧光染色法检测小鼠COCs中卵丘扩展相关因子HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白的表达;Western blot法检测检测小鼠COCs中卵丘扩展相关因子HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白的表达水平;Western blot法检测检测小鼠COCs中MAPK14、MAPK3/1的蛋白表达及其磷酸化水平。结果:1卵丘扩展分级不同级别COCs的形态与结构0级:不能看到卵丘扩展,但卵母细胞开始贴附在培养板上并开始形成单层。1级:可以观察到最小程度的卵丘扩展,此时COCs的外形呈放射状。2级:COCs的外层卵丘细胞开始扩展。3级:除了紧贴卵母细胞的放射冠层卵丘细胞外,其余卵丘细胞都已扩展。4级:所有的卵丘细胞均已扩展,达到最大程度的卵丘扩展。2各组小鼠不同时间点COCs卵丘扩展分级情况的比较注射h CG 6 h、9 h、12 h,与正常组比较,对照组COCs各扩展级别的比率差异无统计学意义（P>0.05）;与正常组比较,补肾组COCs在6 h的1级、9 h和12 h的1级、2级所占比率降低（P<0.05）,在6 h的2级、3级、4级,9 h的3级和12 h的4级所占比率升高（P<0.05）;与对照组比较,补肾组在6 h的1级,9 h的1级、2级和12 h的0级、1级、2级所占比率降低（P<0.05）,在6 h的2级、4级,9 h的3级和12 h的4级所占比率升高（P<0.05）。3各组小鼠不同时间点血清FSH含量的比较注射h CG 6 h、9 h、12 h时,与正常组相比,对照组小鼠血清FSH含量差异无统计学意义（P>0.05）;与对照组相比,补肾组小鼠血清FSH含量升高（P<0.05）。注射h CG 6 h、12 h时,与正常组相比,补肾组小鼠血清FSH含量升高（P<0.05）。4各组小鼠不同时间点COCs中HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2 m RNA表达的比较6 h:与正常组相比,对照组HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2的m RNA表达差异无统计学意义（P>0.05）;与正常组相比,补肾组HAS2的m RNA表达差异无统计学意义（P>0.05）,TNFAIP6、PTX3、PTGS2的m RNA表达升高（P<0.05）;与对照组相比,补肾组HAS2、PTGS2的m RNA表达差异无统计学意义（P>0.05）,TNFAIP6、PTX3的m RNA表达升高（P<0.05）。9 h:与正常组相比,对照组HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2的m RNA表达差异无统计学意义（P>0.05）;与正常组相比,补肾组PTGS2的m RNA表达差异无统计学意义（P>0.05）,HAS2、TNFAIP6、PTX3的m RNA表达升高（P<0.05）;与对照组相比,补肾组HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2的m RNA表达升高（P<0.05）。12 h:与正常组相比,对照组HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2的m RNA表达差异无统计学意义（P>0.05）;与正常组相比,补肾组HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2的m RNA表达差异升高（P<0.05）;与对照组相比,补肾组HAS2的m RNA表达差异无统计学意义（P>0.05）,TNFAIP6、PTX3、PTGS2的m RNA表达升高（P<0.05）。5各组小鼠不同时间点COCs中HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白表达的比较5.1免疫荧光法检测各组小鼠不同时间点COCs中HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白的表达HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白在卵丘细胞与卵母细胞中均存在表达。5.2 Western blot检测各组小鼠不同时间点COCs中HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白的表达水平6 h:与正常组相比,对照组HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05）。与正常组相比,补肾组HAS2蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05）;补肾组TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白的表达升高（P<0.05）。与对照组相比,补肾组HAS2、PTX3蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05）;补肾组TNFAIP6、PTGS2蛋白的表达升高（P<0.05）。9 h:与正常组相比,对照组HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05）。与正常组相比,补肾组HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白的表达升高（P<0.05）。与对照组相比,补肾组HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白的表达升高（P<0.05）。12 h:与正常组相比,对照组HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05）。与正常组相比,补肾组HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白的表达升高（P<0.05）。与对照组相比,补肾组HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白的表达升高（P<0.05）。6各组小鼠不同时间点COCs中MAPK14、MAPK3/1蛋白及其磷酸化水平的比较注射h CG 6 h、9 h、12 h时,与正常组相比,对照组MAPK14、MAPK3/1的磷酸化水平差异无统计学意义（P>0.05）。与正常组相比,补肾组MAPK14、MAPK3/1的磷酸化水平升高（P<0.05）。与对照组相比,补肾组MAPK14、MAPK3/1的磷酸化水平升高（P<0.05）。结论:1.补肾调经Ⅱ、Ⅲ号方可促进小鼠卵丘扩展进而促进卵母细胞发育成熟。2.补肾调经Ⅱ、Ⅲ号方可上调小鼠COCs中卵丘扩展相关因子HAS2、TNFAIP6、PTX3、PTGS2蛋白及其m RNA的表达,从而促进卵丘扩展。其中HAS2、TNFAIP6、PTX3是卵丘细胞外基质的重要组成成分,因此补肾调经Ⅱ、Ⅲ号方可改善卵丘细胞外基质。3.补肾调经Ⅱ、Ⅲ号方促进小鼠COCs中卵丘扩展相关因子表达的作用机制可能部分是通过调节小鼠血清FSH的表达水平激活MAPK14、MAPK3/1信号通路实现。