砷（As）与二氧化硫（SO₂）是两种广泛存在于环境中的物质。As是自然界中一种毒性较强的类金属,已被认定为致癌物,短期与长期的As暴露均可对人体健康造成一定负面影响。目前公认人类接触As的非职业途径主要是通过饮水。调查显示,全球高As暴露人群约有两亿人,我国内蒙古,新疆,山西等许多省市均存在饮水型As中毒。与此同时,虽然由于我国能源结构持续优化同时强制推行了工业废气治理政策,我国大中型城市SO₂污染形势依然严峻,但以煤为主的能源结构导致SO₂污染在今后相当长时间内仍会存在于我国的许多地区。此外,一些地区,如我国的云贵地区,由于燃用高As煤后造成燃煤污染型地方性As中毒,该种As污染常常伴随着SO₂污染。以上原因使得两种环境污染物的污染区域产生叠加,使许多受到原生高As地下水影响的居民同时遭遇SO₂污染。已有文献报道,无机As化物经饮水进入机体后主要由肝脏进行甲基化代谢,而肾脏则被认为是As的主要蓄积和排泄器官,因此As暴露可造成肝肾毒性。SO₂也被认为是一种全身性毒物,可造成包括肝肾在内的多器官毒性。同时,越来越多的证据表明As与SO₂不仅可造成全身毒性,还与许多肿瘤的发生发展相关联。此前从未有人对As与SO₂复合暴露的效应进行研究,因此本课题对As与SO₂复合暴露造成的肝肾毒性效应评价及其作用机制进行了研究,以期为同时暴露于As和SO₂人群的肝肾致病机理提供一些理论依据。主要研究内容和结果如下:1、As和SO₂共同暴露对小鼠肝脏组织的毒性效应评价。选取4周龄雄性C57BL/6小鼠进行5 mg/L As与5mg/m³ SO₂（6 h/d）暴露实验,对其肝脏组织进行检测。结果发现,相较于对照组,As与SO₂均可造成小鼠超氧化物岐化酶（Superoxide dismutase,SOD）,过氧化氢酶（Catalase,CAT）等抗氧化酶活力下降,相较于As与SO₂单独暴露组,As与SO₂共同暴露组可造成抗氧化酶类活力进一步下降;As与SO₂共同暴露造成包括O₂^·-和H₂O₂等在内的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）及脂质过氧化反应产物丙二醛（Malondialdehyde,MDA）大量积累,并最终在肝脏中造成了氧化应激损伤。通过检测小鼠肝功能指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）,发现As-SO₂共同暴露组中该两项指标显著上升,证实该组中小鼠肝脏功能较As或SO₂组发生了进一步损伤。同时,相较于As或SO₂单独暴露组中出现的肝脏损伤及炎性细胞浸润,我们在As-SO₂共同暴露组小鼠中还观察到肝脏细胞出现气球样变,并伴随有部分中央静脉和相邻肝窦内充血明显,肝窦变形。由此可知As-SO₂共同暴露造成了更为严重的肝脏组织损伤。借助免疫印迹和定量聚合酶链反应等检测技术,我们发现核转录因子（Nuclear factor kappa B,NF-κB）和信号转导与转录激活因子（Signal transducers and activators of transcription,STAT-3）均受到As-SO₂共同暴露影响,相较于As或SO₂单独暴露组表达量显著上调。NF-κB与STAT-3下游效应因子白介素6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor,TNF-α）及白介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）均表现出相同趋势。研究表明As-SO₂共同暴露加剧氧化应激损伤并诱导NF-κB信号通路激活并入核调控加剧炎性反应,最终造成小鼠肝脏损伤加剧。2、As和SO₂共同暴露对小鼠肾脏组织的毒性效应评价。小鼠暴露方法与第一部分相同,研究发现小鼠肾功能相关指标KIM-1和NGAL在As-SO₂共同暴露后表达量显著升高,表明小鼠肾功能损伤加剧。同时,As-SO₂共同暴露组小鼠肾脏中出现肾小球纤维化等现象,且其炎症细胞浸润现象显著高于其他三组。为探明其分子机制,除检测氧化应激指标及相关炎症因子表达外,我们还进一步检测了细胞自噬与凋亡的关键因子。结果发现,As-SO₂共同暴露可导致小鼠肾脏中氧化应激损伤和炎性反应加剧。同时,As-SO₂共同暴露对自噬途径关键指标微管相关蛋白轻链3（Microtubule associated protein light chain 3,LC-3）及雷帕霉素的哺乳动物靶点（The mammalian target of rapamycin,mTOR）均无显著影响,而凋亡途径中的关键因子,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase）家族中的caspase 3、caspase 7和caspase 9的mRNA表达量均受到As和/或SO₂暴露的影响发生上调。据此我们推测,As-SO₂共同暴露所导致的肾脏组织结构损伤加剧是由氧化应激反应及炎症反应介导的细胞凋亡造成的。为验证上述结论,我们采用人源正常肾上皮293T细胞建立了细胞暴露模型,采取5.5μg/L NaAsO₂和/或0.15 mg/L Na₂SO₃/NaHSO₃（3:1 mmol/L）作为细胞暴露浓度。在使用N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）,BAY11-7082和Z-VAD-FMK分别抑制ROS,NF-κB和caspase活性后,由As和/或SO₂暴露造成的细胞存活率下降均发生逆转。据此,我们得知As-SO₂共同暴露加剧氧化应激损伤→诱导NF-κB信号通路激活并入核调控→激活下游信号因子IL-1β及TNF-α→诱导caspase凋亡信号通路活性→最终造成肾脏损伤加剧。以上发现为As污染地区SO₂职业暴露人群肝肾疾病的防护与治疗提供了一定理论依据。3、已有研究证明As和SO₂暴露对肝癌的发生与发展有促进作用,然而当二者暴露浓度均低于世界卫生组织（World health organization,WHO）制定的现行环境标准时,共同暴露是否仍旧会导致肝癌的进一步恶化未见报道。为此,在本研究中,依据硫含量分别选取0、1×10^-5、2×10^-5、3×10^-5、4×10^-5、5×10^-5和6×10^-5 mg/L进行SO₂暴露,选取0、1×10^-4、1×10^-3和1×10^-2 mg/L作为As处理浓度建立浓度梯度对HepG2进行暴露。最终采用5 10^-5 mg/L SO₂和/或1 10^-3 mg/L As对HepG2细胞暴露120小时。划痕实验结果表明,As或SO₂单独暴露时对细胞迁移无明显影响,但As-SO₂共同暴露则可以促进HepG2细胞迁移,并促进细胞骨架形变。通过采用免疫印迹和定量聚合酶链反应等技术我们发现,As-SO₂共同暴露导致的HepG2细胞迁移是由整联蛋白（Integrin）家族中的Integrinαvβ3介导的,HepG2细胞迁移现象在使用特异性抑制剂Cilengitide后被抑制。此外我们还发现,白介素8（Interleukin-6,IL-8）,转化生长因子（Transforming growth factor-β,TGF-β）及基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）家族均在此过程中起到一定作用。4、由于本研究证实As暴露可通过诱导氧化应激损伤加剧肝肾损伤,据此我们推测抗氧化剂可对As暴露导致的肝肾损伤起到一定的逆转作用。本实验室此前从玫瑰香葡萄果皮中提取到一种混合物,具有较强抗氧化性,并已证实其具有一定的抗癌作用。故本研究通过自由饮水给予昆明小鼠含10 mg/L As的NaAsO₂水溶液8周建立暴露模型,并通过对其隔天灌胃进行2.5 mg/kg·bw或4.5 mg/kg·bw花色苷干预。结果发现,不同浓度的花色苷均对由As造成的氧化应激损伤有一定的缓解作用。花色苷不但可清除由As造成的ROS与MDA水平升高,还能抑制As引起的SOD与CAT酶活性下降。此外,花色苷还对由As暴露造成的炎症因子高表达有一定的缓解作用。综上所述,本课题一方面在小鼠体内发现了As-SO₂共暴露对肝肾的损伤有加剧作用,并在体外实验中验证了其可能的作用机制。另一方面,我们还发现了低浓度的As-SO₂共暴露可促进肝癌细胞HepG2迁移,并阐明了其可能的分子机制。最后我们还发现了本实验室提取的玫瑰香葡萄花色苷对As暴露毒性有缓解作用。以上研究不仅对As与SO₂的毒性研究提供了新思路,同时也为As毒性的防治提供了新方向。