浒苔是一种具有旺盛生长与繁殖能力的大型绿藻,在自然生境中既能够固定生长又可以漂浮生长。固定生长的浒苔可以按照生活史的各个阶段正常生长发育,从而完成世代交替。而漂浮生长的浒苔在适宜其生长与繁殖的条件下能够快速产生出巨大的生物量,引起绿潮暴发,对生态环境和自然景观造成负面影响,甚至导致灾害性后果。自2007年起,我国黄海海域每年春夏之交都会暴发由漂浮浒苔大量繁殖所引发的绿潮。研究表明当绿潮暴发时,浒苔主要通过形成孢子(配子)进行繁殖。因此,深入研究浒苔的孢子形成过程不仅能够揭示浒苔生物量快速扩增机制,更对探寻绿潮暴发的原因及遏制其暴发的措施有着重要意义。浒苔孢子的形成实际是其营养细胞的分化过程。在该过程中,多种生理生化反应发生改变,表观生理指标也相应发生变化。这些生理生化反应可以响应多种环境因子的变化,并引发精细调控过程。研究浒苔孢子形成过程中所进行的精细调控过程,不仅可以深化理解浒苔营养细胞分化过程调控机制,更可以全面认识藻类乃至低等植物细胞分化过程的调控网络。本论文以浒苔为实验材料,以其孢子形成过程为研究内容,阐明了在浒苔孢子形成过程的光合作用变化及其对一氧化氮信号分子的响应过程。首先,研究了在浒苔孢子形成过程中光合作用的变化以及这种变化对孢子形成过程的影响。采用显微水平的形态观察与光合作用表观参数的测定相结合的方法进行实验,发现在孢子囊形成之前,线性电子传递在整个光合电子传递过程中占主导地位,环式电子传递占次要地位,线性电子传递与环式电子传递相互协同使卡尔文循环的运转达到最佳状态。在孢子囊开始形成时,线性电子传递大幅降低,环式电子传递显著加强,该结果表明孢子形成过程特别是孢子囊的形成与光合电子传递的变化密切相关。通过使用不同光合电子传递抑制剂对浒苔孢子形成过程中各个阶段的光合电子传递进行抑制,发现孢子囊形成与不同类型的光合电子传递之间存在关联性。在孢子囊形成之前,使用DCMU与DBMIB这两种抑制机制不同的光合电子传递抑制剂对光合电子传递进行抑制,发现这两种抑制剂均可以有效地抑制孢子囊的形成,DBMIB的抑制效果与处理时间几乎不存在关联性,而DCMU的抑制效果与处理时间呈正相关,表现为随着处理时间延长,抑制效果增强。当孢子囊开始形成之后使用DCMU处理,其抑制效果就不再有效,对后续孢子形成过程没有任何影响,而DBMIB的抑制效果却极为明显。究其原因,DCMU只能有效的阻断线性电子传递,而不影响环式电子传递,并可以使质体醌库一直处于氧化状态,相反DBMIB既可阻断线性电子传递又可阻断环式电子传递,并可使质体醌库一直处于还原状态。对浒苔孢子形成培养过程进行碳源限制发现,如果在培养全过程去除碳源,孢子形成过程将无法进行;而如果在培养前期保持碳源供应,仅在培养的中后期去除碳源,则可以促进孢子囊开始形成。由此可见,碳源的供给对孢子形成过程初期至关重要,而在中后期的碳源限制又为孢子囊开始形成创造了有利条件。实验证明碳源限制可以导致光合环式电子传递的加强与质体醌库的氧化。综合上述实验结果表明,质体醌库的氧化状态与环式电子传递的加强是孢子囊开始形成所必需的,浒苔孢子形成之初依赖卡尔文循环的运转,而一旦孢子囊开始形成就不再需要卡尔文循环。光合作用不仅在浒苔孢子形成过程中发生了变化,而且能够通过改变光合电子传递链的状态来调控该过程。其次,研究了浒苔孢子形成过程对一氧化氮(NO)信号分子的响应途径及其机制,同时检验了NO与其他信号分子如钙离子之间的交互应答对浒苔孢子形成过程的影响。在实验中按照梯度浓度施加不同类型的NO供体,以检验外源NO对孢子形成过程的影响,同时也对相应NO供体的光解副产物进行研究,检验了这些副产物对孢子形成过程的影响,实验结果修正了过去在对真菌研究中得出NO抑制孢子形成的片面认识,表明了NO并不是抑制孢子形成过程的主要抑制物。使用NO清除剂对孢子形成过程造成了抑制,说明了在缺失NO的条件下孢子将无法正常形成。NOS抑制剂对孢子形成过程仅存在微弱抑制作用,说明了正常孢子形成过程所需的全部NO,其中仅有很少一部分是由NOS催化合成。缺失钙离子培养导致孢子形成过程完全受阻,证明外源施加钙离子对孢子形成过程的正常进行是必需的。钙离子通道抑制剂ryanodine处理导致孢子形成过程完全受阻,证实了胞内由ryanodine受体相关通道介导的钙离子释放对孢子形成过程的正常进行是必需的。通过监测不同处理条件(正常、NO清除剂处理、ryanodine处理)下的细胞NO含量,发现正常组的细胞NO含量要远高于NO清除剂处理组与ryanodine处理组,同时NO清除剂处理组与ryanodine处理组的细胞NO含量相差无几。上述实验结果一方面确认NO保证了孢子形成过程的正常进行,细胞NO浓度与孢子形成受抑制程度呈负相关;另一方面发现ryanodine受体相关通道所涉及的钙离子释放与NO浓度存在密切联系。根据DTT处理等一系列实验结果发现,NO能够对ryanodine受体上的半胱氨酸残基进行S-亚硝基化,这种蛋白质修饰可以对孢子形成过程进行调控,是NO调控机制重要的组成部分。半胱氨酸残基S-亚硝基化的ryanodine受体开启相关通道,将存储在细胞器中的钙离子释放到细胞质中,同时钙离子释放也促进了NO的合成,使细胞内NO浓度升高。综合以上实验结果表明NO与钙离子这两个信号分子的交互应答对浒苔孢子形成乃至藻类与低等植物的细胞分化有着不可或缺的重要调节作用。最后,从蛋白质组学和转录组学水平研究了孢子形成过程的变化情况。对直径分别为0.75 mm与1 mm的浒苔藻片进行离体培养,藻片内细胞随即启动孢子形成过程。收集培养0 h、24 h、48 h的0.75 mm藻片进行蛋白质组学水平分析;收集培养0 h与6 h的直径1 mm藻片进行转录组学水平分析。蛋白质组学水平分析结果发现随着孢子形成过程进行,抗逆相关蛋白、细胞骨架相关蛋白、蛋白质合成与折叠相关蛋白质丰度都出现了大幅度上升,这说明在0-48 h这个阶段细胞正在为孢子形成做各项准备;而卡尔文循环相关蛋白质丰度在这一阶段出现了下降,与卡尔文循环的运行变化趋势相吻合;转录组学水平分析结果发现在孢子形成过程初期与ryanodine受体相关的基因转录出现大幅度加强,同时涉及到细胞内离子稳态特别是钙离子稳态、受体活性、离子通道活性的相关基因转录也都出现显著变化,与NO与钙离子交互应答对孢子形成过程的调节机制相印证。上述研究的结果说明,在浒苔孢子形成过程中,包括光合作用在内的众多生理过程与生化反应都发生了剧烈的变化,同时一氧化氮等多种信号分子共同参与了对浒苔孢子形成过程的调控。光合作用变化以及一氧化氮信号分子对孢子形成过程的调控意味着,孢子形成过程受到多层次、多关键节点的网络式调控,孢子形成过程的正常进行需要不同调控机制间协调配合。