背景缺血后再灌注是一把“双刃剑”,在恢复血流挽救濒死心肌的同时,也导致心肌功能和结构进一步破坏,这种现象被称为缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,IRI)。糖尿病是缺血性心脏病的独立危险因素,不仅加重了心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI),且使大多数干预措施对 MIRI的保护作用减弱甚至消失,但具体机制尚不明确。因此,寻找减轻糖尿病MIRI的干预措施是研究人员关注的焦点。右美托咪陡(dexmedetomidine,DEX)是一种新型高选择性α2肾上腺素能受体激动剂,具有镇静、镇痛和抑制交感神经活性等作用,目前在临床麻醉和重症监护治疗中广泛应用。DEX对心血管系统的作用表现为降低心率(heart rate,HR)、稳定血流动力学。在DEX对MIRI保护作用的基础研究中,DEX通过激活信号转导通路发挥抗炎、抗凋亡的作用,从而缩小梗死面积。然而,DEX对糖尿病MIRI的作用及潜在机制的研究目前仍未广泛展开。研究发现,MIRI的发生涉及许多机制的共同参与,凋亡和氧化应激在其中发挥着重要作用。临床和动物研究均已证实,再灌注损伤可启动或加速心肌细胞凋亡进程,导致心肌细胞数量减少和心功能不全。此外,糖尿病亦可引起心肌细胞凋亡增加。因此,细胞凋亡是糖尿病心肌病的一个重要原因。缺血/再灌注过程可加剧活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生,过量的ROS不仅可直接作用于心肌细胞引起细胞膜脂质过氧化、核酸DNA损伤和细胞内蛋白质变性,而且还可作为细胞内信使,通过激活多种信号转导通路间接造成组织损伤。当心肌组织发生氧化应激时,Keap1-Nrf2/ARE信号转导通路被激活,Nrf2驱动抗氧化防御机制,调控多种靶基因表达,诱导内源性抗氧化酶产生,从而影响机体的氧化应激水平,在改善心脏重塑和心功能障碍中发挥着十分重要的作用。此外,Keap1-Nrf2/ARE信号转导通路是糖尿病患者抵抗氧化应激心肌损伤的关键通路,而DEX对IRI的保护作用也与抗氧化应激密切相关,通过抑制氧化应激可以减轻脑、肺和肾IRI。由此,我们推断糖尿病MIRI、Keap1-Nrf2/ARE信号转导通路和DEX干预的保护作用之间必然存在着密切联系,但具体机制需要进一步的研究来揭示。基于上述分析,我们设计了这一实验,旨在明确DEX预处理对糖尿病MIRI的保护作用,并明确抗凋亡和抗氧化应激在其中发挥的作用,这有利于进一步阐明DEX预处理的糖尿病MIRI的保护作用及其机制,为临床治疗糖尿病MIRI提供新的思路。本实验共分为四部分:第一部分:糖尿病大鼠模型的建立本部分实验旨在为研究DEX对病理情况下MIRI的影响建立合适有效的糖尿病模型。将306只8周龄的雄性SD大鼠随机分成正常组(N组,138只)和糖尿病组(D组,168只)。N组采用普通饲料喂养8周。D组腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)50 mg/kg联合高脂高糖饲料喂养8周,在此过程中血糖水平持续大于16.65 mmol/L作为血糖升高标准。饲养过程中,连续8周观察体重和血糖水平,饲养结束后统计每组死亡率和糖尿病模型建立成功率。结果显示,N组和D组死亡率分别为2.2%和4.8%,两组死亡率比较差异无显著统计学意义(P>0.05),建立糖尿病模型的成功率为90%。在注射药物前和给药后2天时,N组和D组的体重比较差异无显著统计学意义(P>0.05),在给药后1周、2周、4周、6周和8周时,与N组相比,D组体重明显升高(P<0.05)。在注射药物前,N组和D组的血糖水平比较差异无显著统计学意义(P>0.05),在给药后2天、1周、2周、4周、6周和8周时,与N组相比,D组血糖水平明显升高(P<0.05)。第二部分:右美托咪啶预处理对糖尿病心肌缺血/再灌注损伤保护作用的实验研究本部分实验是通过比较DEX预处理对正常和糖尿病MIRI的保护作用,旨在评价糖尿病对DEX预处理心肌保护作用的影响。将32只正常和32只糖尿病成年雄性SD大鼠随机分成8组(每组8只):正常空白对照组(S组)、正常IRI对照组(C组)、正常缺血预处理组(IPC组)、正常右美托咪啶预处理组(DEX组)、糖尿病空白对照组(DS组)、糖尿病IRI对照组(DC组)、糖尿病缺血预处理组(D+IPC组)和糖尿病右美托咪啶预处理组(D+DEX组)。在实验过程中,连续监测血流动力学和心律失常。再灌注结束时抽取血标本测定血清肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase-MB,CK-MB)和心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin I,cTnI)浓度。随后采用伊文思蓝和氯化三苯基四氮挫双重染色检测心肌梗死面积(Infarction size,IS)。结果显示,与正常大鼠相比,糖尿病大鼠对应DS组、DC组、D+IPC组和D+DEX组血糖水平明显升高(P0.05);各组体重、体温和HR、MAP、RPP的基础值比较差异无显著统计学<意义(P>0.05)。与C组相比,IPC组缺血和再灌注期室性心律失常评分明显降低(P<0.05);在再灌注初期,与IPC组相比,DEX组室性心律失常评分明显升高(P<0.05)。与C组相比,IPC组和DEX组IS、血清CK-MB和cTnI浓度明显降低(P<0.05);与IPC组相比,DEX组血清CK-MB和cTnI浓度明显升高(P<0.05),但IS差异无显著统计学意义(P>0.05);与DC组相比,D+IPC组和D+DEX组血清CK-MB和cTnI浓度明显降低(P<0.05),但IS差异无显著统计学意义(P>0.05);与D+IPC组相比,D+DEX组血清CK-MB浓度明显升高(P<0.05),但血清cTnI浓度和IS差异无显著统计学意义(P>0.05)。与正常大鼠C组和DEX组相比,糖尿病大鼠对应DC组和D+DEX组血清CK-MB和cTnI浓度明显升高(P<0.05),但IS差异无显著统计学意义(P>0.05);与正常大鼠IPC组相比,糖尿病大鼠对应D+IPC组IS、血清CK-MB和cTnI浓度明显升高(P<0.05)。第三部分:右美托咪啶预处理对糖尿病心肌缺血/再灌注损伤中细胞凋亡影响的实验研究本部分实验是通过比较DEX预处理对正常和糖尿病MIRI细胞凋亡的影响,旨在确定细胞凋亡是否参与DEX预处理对糖尿病MIRI的保护作用机制。将30只正常和30只糖尿病成年雄性SD大鼠随机分成6组(每组10只):正常空白对照组(S组)、正常IRI对照组(C组)、正常右美托咪啶预处理组(DEX组)、糖尿病空白对照组(DS组)、糖尿病IRI对照组(DC组)和糖尿病右美托咪啶预处理组(D+DEX组)。于再灌注120min时留取大鼠左心室缺血区心肌标本,应用Tunel染色检测心肌细胞凋亡指数(AI);通过免疫蛋白印迹分析技术(Western-blot)检测心肌Bax和Bc1-2表达水平;在光学显微镜和电子显微镜下观察心肌细胞形态。结果显示,与S组相比,C组和DEX组AI和心肌Bax表达水平明显升高(P<0.05)以及心肌Bc1-2表达水平和Bc1-2/Bax 比值明显降低(P<0.05);与C组相比,DEX组AI明显降低(P<0.05)以及心肌Bc1-2表达水平和Bc1-2/Bax 比值明显升高(P<0.05);与DS组相比,DC组AI和心肌Bax表达水平明显升高(P<0.05)以及心肌Bc1-2表达水平和Bc1-2/Bax 比值明显降低(P<0.05);与DC组相比,D+DEX组AI和心肌Bax表达水平明显降低(P<0.05)以及Bc1-2/Bax比值明显升高(P<0.05)。与正常大鼠S组相比,糖尿病大鼠对应DS组AI和心肌Bax表达水平明显升高(P<0.05),Bc1-2/Bax比值明显降低(P<0.05);与正常大鼠C组相比,糖尿病大鼠对应DC组AI和心肌Bax表达水平明显升高(P<0.05),但Bc1-2/Bax比值差异无显著统计学意义(P>0.05);与正常大鼠DEX组相比,糖尿病大鼠对应D+DEX组AI明显升高(P<0.05),但心肌Bax和Bc1-2表达水平和Bc1-2/Bax比值差异无显著统计学意义(P>0.05)。在光学显微镜和电子显微镜下观察,DEX组心肌细胞略肿胀,结构损伤减轻,心肌细胞排列较整齐,线粒体形态正常,结构完整,损伤程度较C组减轻;D+DEX组心肌细胞肿胀,心肌细胞排列不规则,间质内炎细胞浸润,部分线粒体肿胀甚至破裂,损伤程度较DC组减轻。第四部分:Keap1-Nrf2/ARE信号转导通路在右美托咪啶预处理对糖尿病心肌缺血/再灌注损伤保护中作用的实验研究本部分实验旨在探讨Keap1-Nrf2/ARE信号转导通路在糖尿病影响DEX预处理心肌保护中的作用和机制。将70只正常和70只糖尿病成年雄性SD大鼠随机分成14组(每组10只):正常空白对照组(S组)、正常IRI对照组(C组)、正常右美托咪啶预处理组(DEX组)、应用tBHQ的正常对照组(tBHQ组)、应用tBHQ的正常右美托咪啶预处理组(tBHQ+DEX组)、应用ATRA的正常对照组(ATRA组)、应用ATRA的正常右美托咪啶预处理组(ATRA+DEX组)、糖尿病空白对照组(DS组)、糖尿病IRI对照组(DC组)、糖尿病右美托咪啶预处理组(D+DEX组)、应用tBHQ的糖尿病对照组(D+tBHQ组)、应用tBHQ的糖尿病右美托咪啶预处理组(D+tBHQ+DEX组)、应用ATRA的糖尿病对照组(D+ATRA组)和应用ATRA的糖尿病右美托咪啶预处理组(D+ATRA+DEX组)。再灌注结束时抽取血标本检测血清CK-MB和cTnI浓度,随后检测IS。留取大鼠左心室缺血区心肌组织标本,Western-blot检测心肌Nrf2、HO-1和NOQ1表达水平,化学法检测缺血心肌组织氧化应激指标SOD、MDA 和 GSH-Px 水平。结果显示,与C组相比,DEX组、tBHQ组和tBHQ+DEX组IS、血清CK-MB和cTnI浓度明显降低(P<0.05);与DEX组相比,tBHQ+DEX组IS、血清CK-MB和cTnI浓度明显降低(P<0.05),ATRA+DEX组IS、血清CK-MB和cTnI浓度明显升高(P<0.05);和tBHQ组相比,tBHQ+DEX组IS、血清CK-MB和cTnI浓度明显降低(P<0.05);和ATRA组相比,ATRA+DEX组IS明显降低(P<0.05)以及血清CK-MB和cTnI浓度差异无显著统计学意义(P>0.05);与DC组相比,D+ATRA组IS、血清CK-MB和cTnI浓度明显降低(P<0.05);与D+DEX组相比,D+tBHQ+DEX 组 IS 和血清 CK-MB 浓度明显升高(P<0.05),D+ATRA+DEX组IS、血清CK-MB和cTnI浓度差异无显著统计学意义(P>0.05);与D+tBHQ组相比,D+tBHQ+DEX组IS、血清CK-MB和cTnI浓度差异无显著统计学意义(P>0.05);与 D+ATRA 组相比,D+ATRA+DEX 组 IS、血清 CK-MB 和 cTnI 浓度明显升高(P<0.05)。与正常大鼠C组和DEX组相比,糖尿病大鼠对应DC组和D+DEX组IS、血清CK-MB和cTnI浓度明显升高(P<0.05)。与C组相比,DEX组、tBHQ组和tBHQ+DEX组心肌Nrf2、HO-1和NOQ1表达水平明显升高(P<0.05),ATRA和ATRA+DEX组差异无显著统计学意义(P>0.05);与 DEX 组相比,tBHQ 组和 tBHQ+DEX 组心肌 Nrf2、HO-1 和 NOQ1表达水平明显升高(P<0.05),ATRA和ATRA+DEX组明显降低(P<0.05);与DC 组相比,D+DEX 组、D+tBHQ 组和 D+tBHQ+DEX 组心肌 Nrf2、HO-1 和 NOQ1表达水平明显升高(P<0.05),D+ATRA和D+ATRA+DEX组心肌Nrf2和HO-1表达水平明显降低(P<0.05);与D+DEX组相比,D+tBHQ组和D+tBHQ+DEX组心肌Nrf2表达水平差异无显著统计学意义(P>0.05)以及心肌HO-1和NOQ1表达水平明显升高(P<0.05),D+ATRA和D+ATRA+DEX组心肌Nrf2和HO-1表达水平明显降低(P<0.05)。与正常大鼠C组和DEX组相比,糖尿病大鼠对应DC组和D+DEX组心肌Nrf2和HO-1表达水平明显升高(P<0.05)以及心肌NOQ1表达水平明显降低(P<0.05)。与C组相比,DEX组、tBHQ组和tBHQ+DEX组心肌GSH-Px水平明显升高(P<0.05)以及心肌MDA水平明显降低(P<0.05),ATRA和ATRA+DEX组差异无显著统计学意义(P>0.05);与DEX组相比,tBHQ+DEX组心肌SOD和GSH-Px水平明显升高(P<0.05)以及心肌MDA水平明显降低(P<0.05);与DC组相比,D+DEX组、D+tBHQ组和D+tBHQ+DEX组心肌SOD和GSH-Px水平明显升高(P<0.05)以及心肌MDA水平明显降低(P<0.05);与D+DEX组相比,D+ATRA和D+ATRA+DEX组心肌GSH-Px水平明显降低(P<0.05)以及心肌MDA水平明显升高(P<0.05)。与正常大鼠C组和DEX组相比,糖尿病大鼠对应DC和D+DEX组心肌GSH-Px水平明显降低(P<0.05)以及心肌MDA水平明显升高(P<0.05)。结论通过本实验,我们得出以下结论:1.虽然IPC和DEX预处理对正常MIRI具有明显保护作用,但对糖尿病MIRI的保护作用明显减弱。2.缺血/再灌注所致的糖尿病心肌细胞凋亡明显强于正常心肌。3.DEX预处理可明显抑制缺血/再灌注后正常和糖尿病心肌细胞凋亡,并明显改善心肌细胞形态学,提示抑制细胞凋亡可能是DEX预处理发挥心肌保护的作用机制之一。但是糖尿病可明显减弱DEX预处理抑制缺血/再灌注后缺血区心肌细胞凋亡的作用。4.DEX预处理可通过激活Keap1-Nrf2/ARE信号转导通路发挥抗氧化应激作用而对正常MIRI发挥保护作用,但对糖尿病MIRI的保护作用明显减弱。5.DEX预处理对糖尿病MIRI保护作用减弱可能是归因于糖尿病心肌增强的细胞凋亡和Keap1-Nrf2/ARE信号转导通路紊乱。