缺血型胆道损伤的防护对于改善移植肝胆道血供,提高肝移植后的成功率具有重要意义。缺血型胆道损伤是一个由多因素参与的复杂的病理过程,移植肝胆道的血供主要来自肝动脉,最终肝动脉的狭窄或闭塞发挥着重要作用。重组人生长激素对组织缺血性损伤具有保护作用,有增加机体蛋白合成能力、改善机体免疫功能、降低应激反应,及刺激胰岛素样生长因子Ⅰ生成增加等诸多功能。本课题利用简便实用的大鼠自体原位肝移植模型,并造成缺血型胆道损伤,应用重组人生长激素进行术后干预,术后观察肝内胆道超微结构及微循环的变化和胆管上皮细胞凋亡、增生及相关调控因子的表达情况,研究探讨重组人生长激素对肝移植缺血型胆道损伤的防护作用及相关机制,为生长激素应用于肝移植后的胆道保护提供理论研究和实验基础。国内国外,此方面的工作尚无文献报道及有关记载。第一部分缺血型胆道损伤对肝移植胆道超微结构的影响及生长激素的保护作用目的：应用重组人生长激素,对大鼠自体原位肝移植术后缺血型胆道损伤进行术后干预,观察胆道超微结构改变,探讨生长激素对肝移植缺血型胆道损伤的保护作用与机制。材料与方法：1.动物分组与模型制备选用wistar系雄性大鼠18只,体重200±20g,随机分为3组：对照组(CON组)、缺血型胆道损伤组(ITBL组)和rhGH处理组(rhGH组),每组6只。CON组仅进行自体原位肝移植；rhGH组于术后3h结扎肝动脉,并且皮下注射rhGH 0.3IU/kg/天共一周；ITBL组于术后3h结扎肝动脉,并且皮下注射等量生理盐水一周。2.标本的采集与处理术后7天再次开腹,快速获取左肝外叶胆道组织,部分置于10%多聚甲醛溶液以备光镜检查,部分置于2.5%戊二醛固定液中以备透射电镜分析。3.检测指标(1)胆道组织病理检测取上述10%多聚甲醛所固定组织,稍加修整,制成组织蜡块、切片,常规HE染色。高倍镜视野下,观察胆管上皮水肿、炎细胞浸润、上皮坏死脱落等情况。(2)胆道透射电镜观察及图像分析取上述2.5%戊二醛所固定组织,制成电镜标本,电镜观察各组胆管上皮微观结构改变,并用图像分析系统对其损伤程度进行定量分析。4.统计分析：全部数据均由SPSS13.0软件进行统计学处理。多组间比较用方差分析(ANOVA),随后用合适的方法作多重比较。数据结果采用均数±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.胆管组织学变化HE染色显示,CON组以胆管上皮水肿、炎细胞浸润等可逆性损伤为主；ITBL组以上皮大部分坏死脱落等不可逆损伤为主；而rhGH组,胆道上皮坏死脱落明显减少,以胆管上皮水肿、炎细胞浸润为主。2.透射电镜观察术后1周CON组可见胆管的粘膜皱褶饱满,起伏自然,无上皮层破损,胆管上皮细胞呈圆形或椭圆形,形态规则,大小均一,排列整齐,表面微绒毛较丰富；ITBL组可见胆管上皮细胞呈蜂窝状坏死,基层胶原纤维裸露,残余上皮细胞欠规则,间距较大,表面微绒毛稀疏；rhGH组可见细胞数量增多,形态基本正常,细胞间距基本正常,表面微绒毛丰富但形态欠均匀。3.胆管上皮透射电镜图像分析ITBL组的胆管上皮细胞面积密度、数密度和微绒毛面积密度等平面计量学参数均显著小于CON组和rhGH组(P<0.05)；rhGH组的胆管上皮细胞平面计量学参数较ITBL组有明显改善(P<0.05),但仍较CON组低(P<0.05)。第二部分缺血型胆道损伤对肝移植胆道微循环的影响及生长激素的保护作用目的：应用重组人生长激素,对大鼠自体原位肝移植术后缺血型胆道损伤进行术后干预,观察肝内胆道微循环变化,探讨生长激素对肝移植缺血型胆道损伤的保护作用与机制。材料与方法：1.动物分组与模型制备选用wistar系雄性大鼠18只,体重200±20g,随机分为3组：对照组(CON组)、缺血型胆道损伤组(ITBL组)和rhGH处理组(rhGH组),每组6只。CON组仅进行自体原位肝移植；rhGH组于术后3h结扎肝动脉,并且皮下注射rhGH 0.3IU/kg/天共一周；ITBL组于术后3h结扎肝动脉,并且皮下注射等量生理盐水一周。2.标本的采集与处理术后7天再次开腹,快速获取左肝外叶胆道组织,置于10%多聚甲醛溶液以备石蜡切片。3.检测指标(1)病理学检查：石蜡标本2.5μm切片,常规HE染色。观察汇管区炎症细胞浸润及胆管结构破坏程度。(2)石蜡标本2.5μm连续切片,用兔抗CD34多克隆抗体标记血管。计数汇管区胆管数、血管数、伴有血管的胆管数、不伴有血管的胆管数及孤立的血管数。4.统计分析：全部数据均由SPSS13.0软件进行统计学处理。多组间比较用方差分析(ANOVA),随后用合适的方法作多重比较。数据结果采用均数±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.胆管病理形态观察ITBL组胆管上皮细胞排列明显缺失,管壁无增厚,汇管区也无明显炎症细胞浸润。CON组、rhGH组胆管上皮细胞呈慢性增生性炎症改变,管壁明显增厚,汇管区炎性细胞增多,胆管上皮细胞增生2.汇管区胆管及血管的变化胆道缺血性损伤后,汇管区胆管受损,ITBL组较CON组汇管区胆管数明显减少(P<0.05); rhGH处理后,汇管区胆管增生,rhGH组较ITBL组汇管区胆管数明显增加(P<0.05)。缺血型胆道损伤后,伴有血管的胆管数量较CON组明显减少,而不伴有血管的胆管数却明显增加(P<0.05); rhGH处理后,伴有血管的胆管数量较ITBL组明显增多,而不伴有血管的胆管数却明显减少(P<0.05)。第三部分生长激素对肝移植缺血型胆道损伤的保护作用及其机制目的：探讨外源性生长激素对大鼠肝移植缺血型胆道损伤的保护作用及其机制。材料与方法1.动物分组与模型制备选用wistar系雄性大鼠18只,体重200±20g,随机分为3组：对照组(CON组)、缺血型胆道损伤组(ITBL组)和rhGH处理组(rhGH组),每组6只。CON组仅进行自体原位肝移植；rhGH组于术后3h结扎肝动脉,并且皮下注射rhGH 0.3IU/kg/天共一周；ITBL组于术后3h结扎肝动脉,并且皮下注射等量生理盐水一周。2.标本的采集与处理术后7天再次开腹,快速采取下腔静脉血液离心取上清液,取左外叶肝组织置于10%多聚甲醛溶液保存。3.检测指标(1)血清ALT和ALP检测。(2)免疫组化法检测胆管上皮细胞VEGF、VEGFR2、VEGFR3、IGF-1R和GHR表达。封片后用Olympus U-25ND6 T2显微镜观察显微结构,用IAS图像分析系统(Delta Sistemi)分析图像,估算免疫组化染色的强度和分布。(3)胆管上皮细胞的PCNA标记用半定量法测定。在20个随机的高倍视野(-400)计数500个胆管细胞,计算PCNA阳性细胞百分数,由此估算PCNA标记指数。只有表达核免疫染色强阳性的细胞才‘被列入阳性计数。(4)采用TUNEL法按细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行检测,光镜下观察各组大鼠肝内胆管上皮细胞凋亡情况。在高倍视野(×400)下盲法检测每个组织样本中凋亡细胞数。用凋亡指数进行定量,即30个随机显微高倍视野的阳性细胞数来算出TUNEL阳性胆管上皮细胞百分数。4.统计分析：全部数据均由SPSS13.0软件进行统计学处理。多组间比较用方差分析(ANOVA),随后用合适的方法作多重比较。数据结果采用均数±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义。结果1. ITBL组的ALT和ALP显著高于对照组(P<0.05); rhGH组ALT和ALP较ITBL组明显降低(P<0.05),然而仍高于CON组(P<0.05)。2.免疫组化检测显示,ITBL组肝脏表达VEGF、VEGFR2、VEGFR3、GHR和IGF-1R阳性胆管上皮细胞数较CON组减少(P<0.05); rhGH组阳性表达较ITBL组明显提高(P<0.05),但仍较CON组低(P<0.05)。3. TUNEL分析显示,CON组大鼠表达少量凋亡细胞,ITBL组大鼠胆管上皮细胞凋亡较CON组增加(P<0.05), rhGH处理抑制ITBL所致的胆管上皮细胞凋亡(P<0.05)。4. ITBL组PCNA阳性胆管上皮细胞数较对照组减少(P<0.05), rhGH处理解除ITBL对PCNA阳性胆管上皮细胞数的抑制(P<0.05)。结论：1.缺血型胆道损伤直接损害胆管上皮细胞,使胆道超微结构破坏,外源性生长激素处理明显减轻肝移植缺血型胆道损伤,对胆道具有保护作用。2.缺血型胆道损伤使肝内胆道微循环受损,而外源性生长激素促进肝内胆道微循环的恢复从而对胆道有保护作用。3. rhGH处理明显减轻肝移植肝内缺血型胆道损伤,这可能与rhGH通过提高肝内胆管上皮细胞VEGF、VEGFR-2、VEGFR-3、GHR和IGF1-R表达,从而抑制凋亡、促进增生有关。