第一部分PD-L1在下咽鳞癌中的表达及其与临床病理学特征的相关性研究实验目的下咽鳞状细胞癌(HSCC)为恶性程度较高的一类头颈部鳞状细胞癌(可简称鳞癌),近年来,尽管手术、放化疗与靶向疗法等综合疗法已获得了显著成果,然进展期HSCC病人的预后依然不佳,5年生存率不足40%。远端转移是造成HSCC病人死亡的关键因素,特别是对于接受综合治疗后的患者,远处转移始终是下咽鳞癌诊疗方面不易预测且难以治疗的问题。因此,深入研究下咽鳞癌发生发展的机制、寻找可以预测疾病进展及预后的标志物、探索新的治疗靶点是改善进展期下咽鳞癌患者生存及生活质量的关键。PD-L1(程序性死亡配体-1)属于一类免疫抑制分子,其结合程序性死亡分子-1(PD-1),能够对T细胞介导的抗肿瘤免疫作用施以有效抑制,显著影响肿瘤免疫逃逸。既往研究表明在多种人类实体肿瘤中均有PD-L1阳性表达,且具有重要的临床及预后意义。同时PD-L1也是目前免疫治疗的重要靶点。但是在下咽鳞癌中,还没有充分明确PD-L1的确切表达以及此分子影响临床病理学表现与预后状况。实验方法收集2005年01月至2014年11月此阶段内就医于我科的95例HSCC病人临床与病理学资料,包括病人年龄、性别、T分期、临床分期、N分期、远端转移、分化状况与预后状况等。收集95例下咽鳞癌患者的肿瘤组织及其配对的癌旁粘膜组织,借助免疫组化(IHC)染色法对肿瘤与黏膜组织内PD-L1表达水平进行测定。应用卡方检验或Fisher精确概率法分析肿瘤组织中PD-L1表达量同病人临床病理学表现间的联系。借助Kaplan-Meier法来分析PD-L1表达同预后间的联系,并完成生存曲线的绘制,针对生存率指标,借助Log-rank检验法开展对比分析,最后借助Cox回归模型来揭示同预后相关的诸多因素。实验结果在95名HSCC病人的肿瘤组织内,PD-L1阳性表达者为42例,达44.21%阳性表达率;但于癌旁粘膜组织内无PD-L1阳性表达现象。PD-L1表达量显著相关于病人的远端转移、N分期与临床分期(χ2=20.850、14.317、7.878,P值皆在0.05以下)。生存分析结果表明,相较于PD-L1表达阴性病人,在预后方面,PD-L1阳性表达病人为较差表现(χ2=37.01且P值在0.001以下)。经多因素Cox回归分析发现,PD-L1阳性表达是同HSCC病人预后相关的独立危险因素(P=0.002,HR=2.703,95%CI:1.455-5.022)。结论PD-L1在下咽鳞癌中可呈阳性表达,其表达水平与疾病进展及预后有着显著关联,PD-L1是同HSCC病人预后相关的独立危险因素,可作为预测下咽鳞癌患者疾病进展及评估预后的生物标记物。第二部分PD-L1调控下咽癌FaDu细胞侵袭转移的潜在作用机制研究实验目的既往研究证实,多种人类肿瘤均可出现PD-L1的阳性表达,并且其表达水平与患者的临床病理学特征及治疗后转归具有显著的相关性。此项课题第一部分研究结果显示,在HSCC中PD-L1阳性表达皆显著相关于临床分期、不良预后、远端转移与颈部淋巴结转移,PD-L1是同HSCC病人预后相关的独立危险因素,这提示PD-L1可能参与了下咽鳞癌的发生发展。另外,许多临床研究也证实,PD-L1阻断疗法能够使晚期肿瘤病人的疾病进展大幅减慢,同时对预后具改善作用。通常认为,在提升肿瘤侵袭性方面,PD-L1的作用机制为,对T细胞介导的免疫反应进行抑制,从而建立免疫抑制微环境,由此对肿瘤细胞免疫逃逸的出现与肿瘤进展起促进作用。但是最近的研究表明,PD-L1同时也具有调节肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭与放化疗抵抗的效能,且和肿瘤细胞上皮-间质转化(EMT)的发生有密切的关系。但是在下咽鳞癌进展过程中,PD-L1这些内在的、自主的生物学功能并未得到充分的阐明。本课题旨在研究PD-L1在调控下咽癌FaDu细胞侵袭转移中的作用,同时对潜在的作用机制展开讨论。实验方法通过siRNA与过表达质粒对人HSCC FaDu细胞行转染处理,下调及上调PD-L1表达水平,应用Western blot实验检测不同处理组FaDu细胞中PD-L1的表达变化。证实PD-L1的表达水平上调或下调后,借助CCK-8实验对FaDu细胞增殖能力展开测定;借助Transwell实验,对FaDu细胞侵袭与迁移能力展开测定。借助Western blot(WB)法来测定FaDu细胞内PD-L1表达量改变后,相关EMT相关蛋白(包括E-cadherin、Vimentin与N-cadherin等)的表达量。为了更为深入地揭示PD-L1在调控EMT中的潜在机制,通过WB实验对FaDu细胞PD-L1表达量波动后信号通路AKT-mTOR的活化状况展开测定。采用过表达质粒与Akt蛋白抑制剂共同处理FaDu细胞,Western blot实验检测FaDu中EMT相关蛋白的表达水平变化。实验结果:抑制PD-L1蛋白表达后,体外细胞实验结果表明,FaDu细胞的侵袭、迁移与增殖活性皆大幅减弱,WB实验表明,E-cadherin于FaDu细胞内蛋白表达上调,Vimentin与N-cadherin蛋白表达则下调。提升PD-L1于FaDu细胞内蛋白表达量,则其增殖、迁移及侵袭能力均显著上升,FaDu细胞内E-cadherin蛋白表达下调,Vimentin与N-cadherin蛋白表达上调。PD-L1于FaDu细胞内的蛋白表达水平与信号通路AKT-mTOR显著相关,若前者水平上调,p-mTOR与p-Akt蛋白表达量提高;若前者水平降低,p-mTOR与p-Akt蛋白表达量降低;而Akt蛋白抑制剂可逆转PD-L1表达上调对Fadu细胞上皮-间质转化的促进作用,说明PD-L1可通过AKT-mTOR信号通路调节FaDu细胞的上皮-间质转化。结论:PD-L1可影响FaDu细胞的增殖、迁移及侵袭能力,其潜在作用机制为PD-L1调控信号通路AKT-mTOR活化,同时对EMT施以进一步调控。PD-L1具有独立于免疫调节之外的自主功能,可作为调控HSCC转移的关键因子,同时在临床治疗HSCC方面可作为新靶点应用。