古菌资源是理论和应用研究的热点之一。古菌中,在DNA聚合酶和相关蛋白协同作用下保证遗传信息的准确传递,这对于生命的延续有着极其重要的作用。研究和开发这些蛋白不仅有理论价值,而且有潜在的市场前景。DNA聚合酶D(DNA polymerase D,Pol D)在古菌中以亲本链为模板不断合成新链,是DNA复制的重要参与者。而Endo Q,Endo MS,UNG等复制相关蛋白则负责消除复制产生的各类错误碱基,保证DNA复制的准确性。Pol D及DNA复制准确性相关蛋白Endo Q,Endo MS,UNG有望应用于提高聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的灵敏度与保真度方面,进一步提升基因片段克隆的效率。本文围绕这些蛋白开展了以下几项研究工作:(1)以E.coli为宿主异源表达来自嗜热古菌(Thermococcus sp.4557)的Pol D,Endo MS,Endo Q和来自鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的UNG;利用Ni-NTA亲和层析、阴离子交换层析、疏水层析等手段,纯化Pol D聚合酶的两个亚基蛋白DP1及DP2;利用“Ni-NTA亲和层析+疏水层析”方法纯化出Endo Q,Endo MS和UNG蛋白。最终得到DP1蛋白22.5 m L(1.49 mg/m L),DP2蛋白11 m L(0.56 mg/m L),Endo Q蛋白12.5 m L(1.31 mg/m L),Endo MS蛋白10 m L(0.92 mg/m L),UNG蛋白6.4 m L(1.62 mg/m L),为后续实验提供材料。(2)用荧光标记DNA探针结合PAGE电泳实验研究Pol D聚合酶两个亚基的功能。结果表明,大亚基DP2具有体外DNA延伸活性,小亚基DP1具有3’?5’核酸外切酶活性。DP2的体系内用量为0.1pmol时仍然可以完成延伸;延伸体系内,若DP1过多则DNA会被完全降解。DP2的存在会明显促进DP1的外切酶活性。复制因子GINS51对DP1的外切酶活性有抑制作用。以上结果补充了Pol D在古菌DNA复制过程中的相关信息。(3)在普通Taq酶催化的PCR反应体系中应用纯化的DNA复制修复因子Endo MS,Endo Q,UNG等蛋白,通过测序PCR扩增产物,统计扩增产物的突变率。结果表明,Endo Q,Endo MS,UNG的介入分别使PCR扩增的产物的整体突变率降低至原来的95.6%,95.3%,90.1%,即提高了PCR反应的保真度。而这些蛋白也可能在高保真DNA聚合酶扩增系统中发挥相似作用。这一新设计有望成为降低高保真度PCR扩增成本的可选途径。综上,本文工作丰富了对Pol D的亚基DP1和DP2,Endo Q,Endo MS,UNG等蛋白的认识,可为提高PCR反应的灵敏度和保真度提供参考。