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[目的]课题组前期研究发现重楼皂苷Ⅰ(PPI)对MCF-7、MCF-7/ADM细胞具有明显的抑制作用。本研究拟检测重楼皂苷I的逆转耐药作用,初步探讨PPI逆转MCF-7/ADM细胞耐药的机制。检测PPI的溶血活性,了解其毒性作用。[方法]1.采用改良MTT法检测MCF-7/ADM细胞对ADM、DDP、5-FU的多药耐药性;选取低细胞浓度的PPI,测试其逆转MCF-7/ADM细胞对ADM、DDP、5-FU的耐药性作用;同时,检测MAPK信号通路抑制剂逆转MCF-7/ADM细胞对ADM的耐药作用。2.采用流式细胞术检测PPI联合ADM对MCF-7/ADM细胞凋亡的影响。3.采用荧光分光光度法检测PPI对MCF-7/ADM细胞内ADM蓄积的影响;并在荧光显微镜下观察细胞内ADM的荧光强度。4.采用 qPCR 法检测 MCF-7、MCF-7/ADM 细胞株中 ABCB1、ABCC1、ABCG2基因表达以及Western blot法检测两株细胞中MAPK信号通路相关蛋白、P-gp蛋白表达情况,确认MCF-7/ADM与MCF-7细胞在分子水平的差异性。5.采用Western blot法检测PPI作用于MCF-7/ADM细胞24、48 h后,对MAPK信号通路蛋白 ERK、P-ERK、JNK、P-JNK、p38、P-p38、以及 P-gp 蛋白表达的影响,以及MAPK信号通路抑制剂对上述蛋白表达的影响。6.采用荧光漂白恢复技术,使用激光共聚焦显微镜检测PPI对MCF-7/ADM细胞荧光漂白恢复率的影响,了解PPI对耐药细胞膜流动性的影响。7.采用比色法测定PPI的体外溶血作用。[结果]1.MCF-7/ADM细胞对ADM、DDP、5-FU均产生耐药性,耐药指数分别为304.43、2.00、7.63。2.PPI 0.3、1、2 μM(低细胞毒浓度)和VER 10μM分别与不同浓度ADM、DDP、5-FU联合,作用MCF-7/ADM细胞48 h后,对ADM的逆转倍数分别为4.67、2.30、32.73 和 29.83;对 DDP 的逆转倍数分别为 1.42、2.32、4.66 和 2.29;对5-FU的逆转倍数分别为2.23、2.69、121.32和1.25。p38通路抑制剂SB20358010、20、40、80μM,对 ADM 的逆转倍数分别为 1.96、3.51、4.64、4.77;JNK通路抑制剂SP600125 10、20、40 μM,对ADM的逆转倍数分别为1.25、1.86、1.82;ERK通路抑制剂U0126 10、20、40、80μM,对ADM的逆转倍数分别为 0.82、0.61、2.25、1.60。3.ADM 5μM 作用 MCF-7、MCF-7/ADM 细胞 48h 后,凋亡率分别为 85.13(P<0.01)、9.40%;对于MCF-7/ADM细胞,经PPI3μM作用后,凋亡率为18.17%(P<0.05);PPI 与 ADM 联合作用,凋亡率上升至 25.87%(P<0.01),ADM联合VER组,凋亡率为24.03%(P<0.01)。4.与ADM共培养3h,MCF-7细胞内ADM的荧光强度为359.63,显著高于MCF-7/ADM细胞内的荧光强度值56.34(P<0.01);经PPI 15、45 μM作用3h后,MCF-7/ADM细胞内ADM蓄积增加,荧光强度分别为136.08(P<0.01)、209.63(P<0.01),经 VER 10 μM 作用 3 h 后,荧光强度增加至 66.28(P<0.01)。5.与 MCF-7 细胞相比,MCF-7/ADM 细胞 ABCB1、ABCC1、ABCG2 基因均高表达,其基因相对表达量分别为4862.931(P<0.001)、1.524(P<0.01)、135.96(P<0.001);MCF-7细胞P-gp、P-p38、P-ERK蛋白的相对表达量分别为0.19、0.61、0.62,显著低于MCF-7/ADM细胞蛋白的相对表达量3.23(P<0.001)、1.40(P<0.001)和 1.18(P<0.01)。6.经PPI 3μM作用MCF-7/ADM细胞24 h,ERK蛋白相对表达量由1.53上调至2.40(P<0.05);作用48h,P-JNK蛋白相对表达量由1.90下调至0.87(P<0.01)。PPI与ADM联合作用24、48h后,P-gp蛋白表达量由3.01、2.72下调至 2.18(P<0.05)、1.96(P<0.001);P-ERK 蛋白表达量由 1.94、1.29下调至1.08、0.91(均P<0.05),P-JNK蛋白表达量由1.95、1.68下调至1.37(P<0.05)、0.7(P<0.001)。MAPK 信号通路抑制剂作用 MCF-7/ADM 细胞 48h,与 Control 组比较,ERK 通路抑制剂 U0126 40 μM,使 P-ERK、P-gp蛋白表达量由1.56、2.61下调至1.17、2.15(均P<0.05);JNK通路抑制剂SP600125 20 μM,使 P-JNK、P-gp 蛋白表达量由 1.87、2.64 下调至 1.45、2.12(均P<0.05);p38 通路抑制剂 SB203580 20 μM,使 P-p38、P-gp 蛋白表达量由1.27、2.91下调至0.84、2.46(均P<0.01)7.MCF-7/ADM细胞荧光漂白恢复率为43.52%,明显高于MCF-7细胞的荧光漂白恢复率 33.14%(P<0.05)。经 PPI 10 μM 作用 1 h 后,MCF-7/ADM 细胞的荧光漂白恢复率下降至26.80%(P<0.01),提示膜流动性降低。8.PPI具有较强的溶血活性,其溶血的半数有效量(ED50)为4.26μM。[结论]1.MCF-7/ADM细胞对化疗药ADM、DDP、5-FU均有耐药性,且对ADM高度耐药,对5-FU中度耐药,对DDP低度耐药。耐药机制可能为:高表达膜转运蛋白P-gp,使药物在细胞内的蓄积明显减少,p38MAPK、ERK信号通路高度激活,细胞膜流动性增加。2.PPI低细胞毒浓度(0.3、1、3 μM)能逆转MCF-7/ADM对3种化疗药的耐药性,3 μM PPI逆转作用强于VER或与VER相当。逆转机制可能为:增加药物在细胞内的蓄积、直接或间接下调P-gp蛋白、抑制JNK、ERK信号通路激活、降低耐药细胞的膜流动性。3.PPI3μM与ADM联合,能诱导MCF-7/ADM凋亡,但与PPI单用差别不大,表明PPI逆转耐药的机制可能不是通过诱导凋亡实现的。4.PPI具有较强的体外溶血活性。