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研究背景 肺癌是当今世界上发病率增长最快和死亡率最高的恶性肿瘤。目前,仅有20%～30%的患者得到早期诊断。尽管采用手术、放疗和化疗等综合治疗措施,由于转移和多药耐药,总的5年生存率仍低于14%。因此寻求新的诊断方法和更有效的治疗方法是肺癌研究的热门话题。现代分子生物学研究证明,肺癌是一种基因性疾病,癌基因的激活或抑癌基因的失活导致细胞异常增殖和凋亡障碍是肺癌发生发展的关键,也是癌细胞产生耐药性的重要机制之一。基因的异常先于形态学改变,因此筛选发生率高、特异性强的异常基因及针对异常基因的靶向治疗策略有望成为肺癌诊断和有效治疗的新方法。Survivin基因是近年发现的一个凋亡抑制基因,不但具有抑制细胞凋亡和促进细胞增殖的功能,而且其表达具有明显的组织特异性,即在正常组织不表达,而在大多数肿瘤中高表达,故受到关注,但目前Survivin在肺癌诊断和靶向治疗中的研究甚少,尚未见纤支镜活检标本和痰液标本检测Survivin基因以及该基因靶向治疗对化疗药Taxol作用的报道。研究目的 (1)明确检测纤支镜活检标本和痰液中Survivin mRNA表达在肺癌诊断中的意义;(2)明确靶向Survivin的反义寡核苷酸(ASODN)对肺癌细胞株Survivin mRNA表达、蛋白表达、细胞生长周期及细胞凋亡的影响;(3)低剂量靶向Survivin ASODN能否增加化疗药物Taxol的敏感性;(4)明确Survivin ASODN联合Bcl-2 ASODN的抑癌效果。研究方法第一部分:应用RT-PCR法检测41例肺癌患者手术标本的癌组织、癌旁组织和9例良性肺疾病肺组织手术标本以及80例肺癌和30例良性肺疾病纤支镜活检标本以及全部的上述160例患者痰液标本Survivin mRNA表达,并与病理组织学、纤支镜刷检细胞学检查和痰液细胞学检查结果相比较。第二部分:(1)在脂质体介导下,分别以100nM、300nM和500nM浓度的Survivin ASODN作用于小细胞肺癌细胞株NCI-H446和肺腺癌细胞株SPC-A1,于24h、48h、72h后用RT-PCR法检测Survivin mRNA表达,Western blot法检测Survivin蛋白,流式细胞仪检测细胞凋亡并分析细胞周期分布。(2)Survivin ASODN单独、联合Taxol或bcl-2 ASODN作用肺癌细胞株NCI-H446后,用MTT法检测细胞生长抑制率,台盼蓝拒染实验检测细胞死亡率,流式细胞仪检测细胞凋亡并计算两药相互作用指数(CDI),当CDI<1时,有协同作用;当CDI<0.7时,协同作用显著。 <WP=4>研究结果第一部分:41例肺癌患者手术切除癌组织标本Survivin mRNA表达的阳性率(70.7%)高于癌旁组织(17.1%)和9例良性肺疾病组织(11.1%)(p均<0.005),而癌旁组织与良性肺疾病组织Survivin mRNA表达的阳性率无显著性差异(p>0.5);80例肺癌患者纤支镜活检标本Survivin mRNA表达的阳性率(63.8%)也高于30例良性肺疾病患者相应标本(13.3%)(p<0.005);肺癌患者手术标本和纤支镜活检标本Survivin mRNA表达与否及表达强度与年龄、性别、病理分型、病理分级、解剖部位及转移均无明显关系(p均>0.05);手术标本和纤支镜活检标本Survivin mRNA检测诊断肺癌的敏感性为63.8%～70.7%,特异性为86.7%～88.9%;肺癌患者痰液Survivin mRNA表达的敏感性(59.5%),痰液标本Survivin诊断肺癌的特异性是84.6%。64例病理组织学和(或)刷检细胞学确诊肺癌而痰癌细胞检查阴性患者,其中35例痰Survivin mRNA表达阳性。痰液Survivin mRNA联合痰液细胞学检出肺癌的阳性率(80.2%)高于痰液细胞学(47.1%)或痰液Survivin mRNA检测(p均<0.005)。与单独痰液细胞学检查相比,两者联合检测使诊断肺癌的敏感性由原来的47.1%提高至80.2%(p<0.005),NPV由原来的37.9%提高至57.9%(p<0.001),特异性不变。第二部分:(1)NCI-H446和SPC-A1细胞皆表达Survivin mRNA和Survivin蛋白。随着Survivin ASODN浓度增加,Survivin mRNA明显下调,其差异具有显著性,其中Survivin ASODN 500nM作用72h时NCI-H446和SPC-A1细胞Survivin mRNA抑制率分别达62.72%和67.43%,效果最佳;随着Survivin ASODN浓度增加,NCI-H446和SPC-A1细胞Survivin蛋白表达亦下降;细胞凋亡和细胞周期分析发现,Survivin ASODN对NCI-H446和 SPC-A1细胞的生长抑制作用随浓度增大和作用时间延长而增强,诱导凋亡作用亦有相似变化。(2)Survivin ASODN单独、联合Taxol或bcl-2 ASODN作用NCI-H446细胞后发现Survivin ASODN联合Taxol作用的效果明显优于两药单独应用。其联用时细胞凋亡率达73.3%,而单独应用时分别为43.6%和23.8%。其联用时细胞生长抑制率达79.69%,而单用的抑制率分别为50.48%和29.90% (p均<0.01)。两药联用组死细胞率达69.9%,高于两药单用(单用分别为41.4%和24.8%)(p均<0.01);CDI值为0.43,表明两药具有显著协同作用。Survivin ASODN与Bcl-2 ASODN联用的效果亦明显优于单独应用。联用的凋亡率为58.6%高于分别单用的43.6%和30.7%(p均<0.01)。联用时细胞生长抑制率为65.35%,亦优于单独应用(单用分别为43.6%和34.88%,p均<0.01),联用组死细胞率为69.9%,也高于两药单用(单用时的31.4%和41.4%,p均<0.01),CDI值为0.53,表明Survivin ASODN 与bcl-2 ASODN联用也具有<WP=5>显著协同作用。结论 (1)纤支镜活检标本Survivin mRNA检测可能成为肺癌诊断的分子标志物之一。(2)痰液Survivin mRNA表达为肺癌无创诊