耐辐射动球菌RecO、RecR的克隆表达及抗紫外辐射损伤效应

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耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)是一种对电离辐射、紫外线耐受性极强的革兰氏阳性细菌,该菌可以在强碱、高盐、高金属离子浓度、高渗透压等极端环境下生存,其极端抗性是由于自身高效而准确的基因修复系统。RecFOR途径是细菌主要的同源重组修复途径之一,主要由RecF、RecO、RecR蛋白组成。到目前为止,K.radiodurans RecFOR途径分子调控机理还未见报道。本论文选择K.radiodurans重组修复RecFOR途径的两个关键基因recO和recR,构建了K.radiodurans recO、recR的原核表达体系,研究RecO、RecR蛋白的抗紫外辐射损伤效应及其对宿主RecFOR途径相关基因的表达调控,为后续紫外生物防护的研究提供科学依据。  生物信息学分析表明RecO、RecR蛋白较为稳定,其二级结构中存在较多的无规则卷曲和α-螺旋,β-螺旋相对较少;利用SWISS-MODEL对RecO、RecR进行同源模建,模建蛋白三级结构的3D模型,这为K.radiodurans RecO和RecR蛋白结构的进一步研究提供一定的帮助。通过PCR扩增耐辐射动球菌recO和recR基因的全长序列,构建重组质粒pGEX-2T-recO和pGEX-2T-recR并转化到大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)中,IPTG诱导重组蛋白表达。结果显示:RecO融合蛋白在0.1mmol/L IPTG,28℃诱导5h时表达量最高;RecR融合蛋白在0.5mmol/L IPTG,30℃诱导2~3h时表达量最高。采用UVC对重组菌做不同剂量的辐射处理,经辐射后E.coli pGEX-2T-recO、E.coli pGEX-2T-recR、E.coli BL21(DE3)和E.coli pGEX-2T的生长都受到抑制,当紫外辐射剂量大于8J/m2,E.colipGEX-2T-recO、E.coli pGEX-2T-recR重组菌开始表现出明显的修复能力,存活率均在其空白对照之上,说明耐辐射动球菌RecR和RecO蛋白能增强E.coli BL21(DE3)对紫外辐射的抵抗能力。  利用实时荧光定量PCR技术检测重组菌中耐辐射动球菌recO、recR基因及E.coli BL21(DE3)中RecFOR途径相关基因recF、recO、recR、recA、recG、ruvA、ruvB、ruvC、ssb的表达情况。结果显示:K.radiotolerans recR的表达量是K.radiotolerans recO表达量的15倍。RecO重组菌中recF、recR、recA、recG、ruvA、ruvB、ruvC、ssb的表达明显高于对照组,RecR重组菌中RecFOR途径其它相关基因的表达与对照组差异均不显著,表明耐辐射动球菌RecR和RecO基因通过不同的调控路径提高E.coli BL21(DE3)的抗紫外辐射能力。上述结果为耐辐射动球菌的耐辐射机制研究提供科学依据。
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