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准噶尔小胸鳖甲(Microdera punctipennis dzungarica)(拟步甲科鳖甲属)是一类分布于中亚古尔班通古特沙漠的荒漠昆虫。准噶尔小胸鳖甲(以下简称小胸鳖甲)成虫避光喜暗,白天栖居于沙土中,夜晚积极活动,在早春季节冰雪尚未完全融化时就可交配产卵,具有很高的耐寒性。产生抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)是荒漠拟步甲昆虫所广泛采取的抗冻机制,避冻昆虫在过冬条件下往往处于过冷却状态使体内蒸汽压高于外界冰的蒸汽压,因而机体面临失水的压力。因此,避冻昆虫的过冷却程度与其抗脱水能力之间的平衡决定了其耐寒性。为研究小胸鳖甲的抗冻策略和抗冻生理机制,检测了不同季节和不同发育阶段的小胸鳖甲的过冷却点(supercooling point,SCP)、体内含水量、体液渗透浓度和抗冻蛋白基因(antifreeze protein gene of Microdera punctipennis,Mpafp)的转录水平,并对这些参数进行了相关性分析。同时,为进一步研究低温和干旱对上述耐寒相关指标的影响,对昆虫分别进行低温和干旱处理,并检测上述指标。结果显示,小胸鳖甲过冬成虫的过冷却点是-18.7℃,在夏季上升到-8.0℃,表明其过冬成虫以降低过冷却点进入深度过冷却状态而过冬,由此判断小胸鳖甲是避冻型昆虫。含水量测定表明过冬状态的小胸鳖甲成虫体内失水量较少,仅降低约10%。表明荒漠甲虫具有很好的防止体内失水的机制,主要原因可归于虫体几丁质化的体壁具有很低的透水性,使虫体在失水或与冰雪接触的过程中具有了有效的保护作用。实时荧光定量PCR的结果显示,小胸鳖甲以合成大量抗冻蛋白(MpAFP)过冬,初秋季节抗冻蛋白就已开始合成,冬季达到高峰,相对转录水平是夏季的13.1倍。与此同时,体液的渗透浓度也从夏季的550 mOsm增加到冬季的1486 mOsm。分析Mpafp mRNA水平与SCP的相关性(相关系数r=-0.8080,相关指数R2=0.6528),表明Mpafp mRNA水平越高,虫体的过冷却点越低。即过冷却点的降低有65.28%是由抗冻蛋白引起的,抗冻蛋白是导致虫体在冬季产生过冷却现象的主要因素。由Mpafp mRNA水平与虫体总水含量的相关性分析得知r=-0.8256,R2=0.6816,表明Mpafp mRNA水平越高,虫体的含水量越低,也可以间接地反映出抗冻蛋白通过降低SCP,刺激水分蒸发而降低虫体含水量。本研究发现,4℃低温胁迫可促使Mpafp mRNA水平不同程度的上调,胁迫达到20d时,其转录水平达到峰值,是对照的8.23倍。而体液渗透浓度的变化趋势与抗冻蛋白转录水平的变化趋势基本一致,成虫在低温胁迫后体液渗透浓度的最大值(756 mOsm)是对照的1.35倍,极显著地高于对照组。含水量测定表明,在长期低温胁迫下,总水含量在3天之内快速下降,之后保持在50%左右。但自由水的含量在3天之内从对照的8.87%升高到了低温胁迫3天时的13.76%,之后保持在15%左右。相关性分析表明,Mpafp mRNA水平与自由水的含量有一定的相关性(r=0.7616,R2=0.5800)。4℃低温胁迫对准噶尔小胸鳖甲成虫的过冷却点无明显的影响。干旱胁迫也可促使Mpafp mRNA水平不同程度地上调,胁迫时间达到15d时,其转录水平达到峰值,是对照的3.53倍。而体液渗透浓度的变化趋势与转录水平的变化趋势一致,成虫在干旱胁迫后体液渗透浓度的最大值(646 mOsm)是对照的1.14倍,显著地高于对照组,但是比Mpafp mRNA水平的变化幅度小。Mpafp mRNA水平与总水含量、绝对水含量有显著相关性(对于总水:r=-0.8161,R2=0.6661,P=0.0476;对于绝对水:r=-0.8174,R2=0.6681,P=0.0470)。干旱胁迫对准噶尔小胸鳖甲成虫的过冷却点也无明显的影响。为了进一步确定在实验室内人工饲养的准噶尔小胸鳖甲是否会产生抗冻蛋白,产生的抗冻蛋白是否具有一定的规律,检测得到了10个不同发育阶段的准噶尔小胸鳖甲转录水平的变化特征。总的来说,在不同发育阶段,Mpafp mRNA水平在大龄幼虫和新孵化出的成虫中较高,并且比夏季(此时的转录水平最低)的还要高,而在幼虫和蛹中较低。Mpafp mRNA水平的最高值出现在成虫期,是卵期的2.1倍,而体液渗透浓度的变化趋势与转录水平的变化趋势基本一致,但比转录水平的变化幅度小。Mpafp mRNA水平与总水和绝对水含量没有相关性,但与SCP有极显著的相关性(r=-0.8595,R2=0.7387)。在实验室条件下饲养得到的蛹,其抗冻蛋白转录水平较低。准噶尔小胸鳖甲在实验室恒温的环境中生长时,不会经历严冬的考验,所以,就不需要产生较高浓度的抗冻蛋白。但是,还是需要表达一定量的抗冻蛋白,以防外界温度突然下降时对自身造成的伤害。根据研究结果,可以得到以下结论:准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因(Mpafp)在不同季节的转录水平不同,秋末冬初较高,夏季较低。体液渗透浓度的变化趋势与转录水平的变化趋势一致。过冷却点呈现出冬季较低、夏季较高的变化趋势。Mpafp mRNA水平与体内总水含量显著相关。由此表明Mpafp mRNA水平越高,虫体的含水量越低,也可以间接地反映出抗冻蛋白通过降低SCP,刺激水分蒸发,从而降低虫体的含水量。低温和干旱胁迫不同程度的增加了Mpafp mRNA水平,但低温胁迫更能提高Mpafp mRNA水平。Mpafp mRNA水平与过冷却点无明显相关性。在实验室内人工饲养的准噶尔小胸鳖甲也有抗冻蛋白的表达,并在大龄幼虫和成虫期的表达量较高,体液渗透浓度的变化趋势与转录水平的一致。Mpafp mRNA水平与过冷却点显著相关。由以上结论总结出准噶尔小胸鳖甲这种避冻型荒漠昆虫的耐寒机制是:当环境遭遇低温时,虫体合成一定量的抗冻蛋白,从而体液渗透浓度增加(而体液渗透浓度的增加主要是由抗冻蛋白的积累引起的),同时虫体的过冷却点降低(而过冷却点的降低进一步促进了抗冻蛋白的积累),刺激机体的水分以梯度的形式蒸发,从而虫体体内的含水量降低(而体内含水量的降低进一步促进了抗冻蛋白的积累),以上四个参数相互作用,致使虫体处于过冷却状态而不结冰,从而获得耐寒性,避免冰冻带来的伤害。