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第一部分EGFR酪氨酸激酶抑制剂对骨肉瘤生物学活性的影响目的:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是最常见的来源于骨组织的恶性肿瘤,常发生于儿童和青少年,具有很高的转移潜能。表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）是多种肿瘤发生的驱动因素,针对EGFR的酪氨酸激酶抑制剂对多种类型的实体肿瘤患者表现出令人鼓舞的抗肿瘤活性,然而其对OS作用的研究仍存在较大争议。本部分研究旨在明确EGFR的酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼（Gefitinib）对OS的抗肿瘤活性,并探讨其作用机制。方法:首先使用免疫印迹实验（Western blot）和实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-q PCR）检测人OS细胞与正常成骨细胞EGFR表达。通过CCK-8法、克隆形成实验、裸鼠皮下移植瘤模型检测吉非替尼对OS细胞增殖和肿瘤生长的影响。使用Transwell法和Western blot检测吉非替尼对OS细胞的迁移、侵袭的影响及其机制。使用流式细胞计数法和Western blot探讨吉非替尼对OS细胞凋亡和周期的影响及相关机制。为了研究吉非替尼影响OS细胞的机制,我们使用Western blot检测EGFR、蛋白激酶B（Akt）,细胞外信号调节激酶（ERK）和信号转导和转录激活因子3（STAT3）蛋白的表达。结果:Western blot和RT-q PCR结果表明,具有成纤维细胞或混合特性的MG63、143B和MNNG-HOS细胞中EGFR蛋白和基因表达升高,与成骨细胞比,基因表达差异具有统计学意义（P<0.01）;而具有上皮特征的U2OS和Saos-2细胞EGFR蛋白和基因呈现为低表达状态。吉非替尼以剂量依赖的方式抑制了OS细胞增殖和移植瘤生长。Transwell实验结果表明吉非替尼通过升高E-cad和降低N-cad表达抑制了OS细胞的迁移和侵袭。此外,吉非替尼处理后,OS细胞凋亡增加,G1期细胞比例增多,与对照组相比差异均具有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果表现为Bax/Bcl-2比值和P27的增加,以及细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）的减少。进一步的机制研究表明,吉非替尼抑制EGFR、Akt和ERK的磷酸化,然而提高了STAT3的磷酸化水平。吉非替尼对EGFR、Akt、ERK和STAT3总蛋白的水平无显著影响。结论:吉非替尼通过阻断EGFR及Akt、ERK信号通路激活从而抑制OS的发生和转移,并促进OS细胞G1期阻滞和细胞凋亡。吉非替尼介导的STAT3蛋白负反馈激活可能参与了OS细胞对EGFR抑制剂的抵抗机制。第二部分EGFR沉默表达对骨肉瘤生物学活性的影响目的:第一部分的研究结果表明,EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼能够抑制OS细胞的生物学活性。然而,EGFR活性抑制对OS发生和进展的影响还需要进一步探究。本部分研究旨在明确OS中EGFR蛋白表达抑制的抗肿瘤活性。方法:使用EGFR沉默（sh-EGFR）和对照（sh-NC）慢病毒转染OS细胞,并通过RT-q PCR和Western blot检测慢病毒转染后EGFR的m RNA和蛋白表达变化。通过CCK-8法、克隆形成实验和构建裸鼠皮下移植瘤模型观察EGFR沉默对OS细胞增殖和肿瘤生长的影响。通过Transwell法观察EGFR沉默对OS细胞迁移和侵袭能力的影响。通过流式细胞计数法观察EGFR沉默对OS细胞凋亡和周期分布的影响。结果:RT-q PCR和Western blot结果显示sh-EGFR组143B和U2OS细胞EGFR的m RNA和蛋白表达均明显低于各自的sh-NC组,差异具有统计学意义（P<0.01）。sh-EGFR组143B和U2OS细胞的增殖、集落形成数量和裸鼠移植瘤生长明显低于各自的sh-NC组,差异具有统计学意义（P<0.01）。Transwell实验结果表明sh-EGFR组143B和U2OS细胞发生迁移和侵袭的数量显著少于各自的sh-NC组（P<0.01）。流式细胞计数结果表明,EGFR沉默后,143B和U2OS细胞凋亡比例增加,并且G1期细胞增多,S期期细胞减少,与对照组相比差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:慢病毒沉默EGFR表达能够抑制OS细胞的增殖、肿瘤生长、细胞迁移和侵袭,并促进OS细胞G1期阻滞和细胞凋亡。第三部分Stattic对吉非替尼介导的骨肉瘤生物学活性的影响目的:第一部分的研究中观察到,吉非替尼介导的EGFR磷酸化抑制能负反馈激活STAT3蛋白发生磷酸化。有研究表明,软组织肉瘤中STAT3磷酸化与肿瘤对吉非替尼的耐药性相关。然而,OS中EGFR与STAT3的相互作用尚未见相关报道。本部分研究旨在探讨OS中STAT3在吉非替尼介导的抗肿瘤活性中的作用及其相关机制。方法:首先使用Western blot检测STAT3酪氨酸激酶抑制剂Stattic处理OS细胞后EGFR蛋白的变化。通过CCK-8实验、克隆形成实验和构建裸鼠皮下移植瘤模型比较吉非替尼（G）、Stattic（S）及两者联用（G+S）对OS细胞增殖和肿瘤生长的影响。使用Transwell法和Western blot比较G、S及G+S处理对OS细胞迁移和侵袭的影响及E-cad和N-cad的变化。使用流式细胞计数法比较G、S及G+S处理对OS细胞凋亡和细胞周期分布的影响,并使用Western blot检测周期和凋亡相关蛋白表达的变化。最后,通过Western blot检测G、S及G+S处理后OS细胞EGFR、Akt,ERK和STAT3蛋白的表达变化。结果:Western blot结果表明,S使p-STAT3表达水平降低,然而却升高了p-EGFR水平。CCK-8实验结果表明,G+S组对143B和U2OS细胞的半抑制浓度低于G组或者S组。并且,G+S组143B和U2OS细胞的集落形成数量、裸鼠移植瘤体积和重量均显著小于各自的G组和S组,差异具有统计学意义（P<0.05）。G+S组143B和U2OS细胞发生迁移和穿过基质胶的细胞数量显著少于各自的G组和S组,差异具有统计学意义（P<0.001）。Western blot结果表明,与G组和S组相比,G+S组OS细胞E-cad表达最高,而N-cad表达最低。此外,G+S组OS细胞发生凋亡的比例和G1期细胞比例显著多于各自的G组和S组OS细胞,差异均具有统计学意义（P<0.01）。Western blot结果表现为G+S组OS细胞Bax/Bcl-2比值和P27增加最明显,而cyclin D1和CDK4减少最明显。进一步的机制研究表明,G+S组同时抑制了EGFR和STAT3的磷酸化水平,并且p-Akt和p-ERK水平也低于G组和S组。G、S及G+S对EGFR、Akt、ERK和STAT3总蛋白的水平均无显著影响。结论:Stattic通过抑制STAT3磷酸化阻断STAT3与EGFR之间的负反馈激活通路,从而增加吉非替尼对OS细胞增殖和转移的抑制,以及对肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的促进。EGFR和STAT3的联合靶向治疗有望成为OS治疗的潜在方案。第四部分Stattic对EGFR沉默表达介导的骨肉瘤生物学活性的影响目的:第三部分的研究中观察到,Stattic能够增加吉非替尼介导的抗OS细胞增殖、肿瘤生长、细胞迁移和侵袭,以及增加吉非替尼对细胞周期进展阻断和细胞凋亡的促进。然而,Stattic对OS细胞中EGFR沉默产生的生物学活性影响的协同作用还需要进一步验证。本部分研究旨在探究Stattic在EGFR沉默介导的抗OS活性中的协同作用。方法:通过CCK-8实验和克隆形成实验分别比较Stattic（S）处理的EGFR沉默（sh-EGFR）和对照（sh-NC）组143B和U2OS细胞的增殖和集落形成数量差异。通过Transwell法比较S处理的sh-EGFR和sh-NC组OS细胞的迁移和侵袭数量差异。使用流式细胞计数法比较S处理的sh-EGFR和sh-NC组OS细胞凋亡比例和细胞周期分布变化。结果:在相同S浓度作用下,sh-EGFR组143B和U2OS细胞的半抑制浓度均低于各自的sh-NC组细胞。sh-EGFR+S组143B和U2OS细胞的集落形成数量显著少于各自的sh-EGFR组和S组,差异具有统计学意义（P<0.001）。sh-EGFR+S组143B和U2OS细胞发生迁移和穿过基质胶的数量显著少于各自的sh-EGFR组和S组,差异具有统计学意义（P<0.01）。此外,sh-EGFR+S组OS细胞发生凋亡的比例和G1期比例显著多于sh-EGFR组和S组OS细胞,差异具有统计学意义（P<0.001）。结论:Stattic增加EGFR沉默对OS细胞增殖、迁移和侵袭的抑制,以及对OS细胞凋亡和细胞G1期阻滞的促进。未来的OS治疗中应考虑EGFR和STAT3的联合靶向治疗方案。