乳腺癌是目前为止女性中发病率最高的肿瘤，早在2002年世界卫生组织就统计出1.15亿的乳腺癌患者。在中国，乳腺癌的发病率以每年3%到4%的速度增加。尽管人们在乳腺癌的分子机制和早期诊断方面已有不小的进步，但是仍有30%的早期乳腺癌病人经治疗后出现复发。寻找新的乳腺癌诊治的靶点是目前亟待解决的问题之一。干扰素调节因子-4结合蛋白(Interferon regulatory factor4-binding protein, IBP)作为鸟苷酸交换因子家族分子(guanine nucleotide exchange factor, GEF),在免疫系统中具有重要作用：参与免疫突触的形成，与Th2细胞极化相关，等等。2009年我实验室首次发现IBP在正常乳腺上皮中不表达，而高表达于肿瘤上皮中，并发现其与乳腺癌的分级分期、转移等相关。这提示IBP的转录调控机制可能与乳腺癌的发生、发展相关，同时提示IBP在乳腺癌中可能具有新的更为重要的功能。然而，目前关于IBP的转录调控机制尚不十分清楚，IBP在乳腺癌中的信号调节网络以及分子功能还有待进一步研究。本课题对IBP在乳腺癌中的异常表达的转录调控机制进行了研究，并通过体外实验初步探讨了IBP在乳腺癌治疗中的意义及其相关机制，研究主要从以下几个方面进行：1.人IBP基因启动子的生物信息学预测及活性分析(1)将不同长度的IBP5′侧翼序列分别克隆入萤光素酶表达载体，并转染HEK293细胞，利用报告基因检测系统，证实IBP核心启动子区域位于-294到-115的区域。(2)利用PROMO程序生物信息学分析发现，在该核心启动子区域具有一个潜在的非经典的p53结合位点。2.野生型p53蛋白对IBP启动子活性及其表达的调控作用(1)将含有预测p53结合位点的并具有最强转录活性的IBP启动子报告基因质粒(pIV)，分别转染HCT116p53-/-和HCT116p53+/+(野生型p53表达)细胞株，发现在p53缺失的HCT116细胞中该片段具有更强的启动子活性。(2)将pIV转染p53抑制的乳腺癌细胞株MCF-7及其对照细胞株，发现内源性p53抑制后IBP的启动子活性增强。(3)利用p53激活剂阿霉素刺激MCF-7细胞，并检测转染的pIV活性，结果阿霉素可以降低IBP的启动子活性。(4)p53真核表达质粒及其突变质粒p53R175H分别与pIV共转染HCT116p53-/-，结果表明野生型p53调节IBP启动子的活性，而p53R175H不影响IBP启动子活性。(5)将p53腺病毒感染HCT116p53-/-细胞，并分别转染IBP启动子报告基因质粒及p53结合位点突变的报告基因质粒，结果表明p53通过预测的p53结合位点调节IBP启动子活性。(6)分别利用定量PCR和Western Blot检测p53腺病毒感染、p53干扰慢病毒感染以及p53抑制剂pifithrin-α、激活剂Nutlin-3刺激的MCF-7细胞中IBP的表达情况，结果表明乳腺癌细胞株中IBP表达与p53表达直接相关，IBP是p53的应答基因。3.体内外实验鉴定野生型p53蛋白与IBP启动子的结合(1)细胞外，采用MCF-7、HCT116p53+/+和HCT116p53-/-核蛋白，利用电泳迁移率转变实验(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)，结合p21探针竞争实验以及p53抗体超位移实验，证明在体外野生型p53蛋白可以与IBP启动子序列结合。(2)结合p53激活剂阿霉素刺激，利用染色质免疫共沉淀技术(chromatinimmunoprecipitation assay, ChIP)，在MCF-7和HCT116p53+/+细胞内证明p53可以和IBP启动子区域结合。4. DNA损伤药物以p53依赖的方式调节IBP的表达(1)利用Western Blot在野生型p53表达乳腺癌细胞株MCF-7和ZR-75-1中证明DNA损伤药物顺铂、阿霉素以剂量、时间依赖的方式抑制IBP的表达。(2)在HCT116p53-/-和p53表达抑制的MCF-7细胞中，Western Blot检测发现顺铂不能抑制IBP的表达，说明DNA损伤药物在乳腺癌中以p53依赖的方式抑制IBP的表达。5.乳腺癌中IBP调节顺铂诱导的细胞凋亡(1)建立稳定的IBP过表达以及IBP表达抑制的MCF-7细胞株，分别检测顺铂对各细胞的增殖抑制作用，计算半数抑制浓度(50%inhibiting concentration，IC50)，结果表明IBP可以降低乳腺癌细胞株对顺铂的敏感性。(2)利用Western Blot检测聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly-adenosine diphosphateribose polymerase，PARP)的表达以及流式细胞分析，进一步发现IBP可以抑制顺铂诱导的细胞凋亡。6.乳腺癌中IBP调节顺铂诱导的细胞凋亡机制的初步研究(1)运用Western Blot检测基础情况下IBP过表达及抑制细胞中p53及其下游p21的表达，发现IBP可以抑制p53的表达，进一步在顺铂刺激的情况下发现，IBP过表达细胞顺铂诱导的p53磷酸化水平下降，提示乳腺癌中IBP过表达可能降低p53的水平及应答活性。(2)进一步检测Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白的表达，发现IBP过表达增加Bcl-2的表达而降低Bax的表达，提示IBP调节了Bcl-2家族的表达，在乳腺癌中破坏了p53依赖的凋亡通路，说明IBP与p53信号通路之间存在有反馈调节。(3)进一步发现IBP过表达细胞中AKT和MDM2蛋白的磷酸化增强，结合AKT抑制剂Ly294002或wortmannin处理后，p53表达量增加，提示IBP在乳腺癌细胞中可能通过AKT调节p53的活性。(4)运用顺铂的细胞毒性实验，在稳定的IBP表达抑制的MCF-7细胞中，发现抑制p53的表达后可以降低细胞对顺铂的敏感性。而在HCT116p53-/-细胞中IBP表达抑制后仍然可以增强细胞对顺铂的敏感性。进一步在IBP过表达的MCF-7细胞中，AKT抑制剂Ly294002联合使用可以增强细胞对顺铂的敏感性。以上结果说明在乳腺癌细胞中IBP可能部分通过AKT/p53途径影响细胞对顺铂的药物敏感性。综上所述，本研究对人IBP基因5′侧翼序列进行了分析，确定了IBP启动子活性区域位于-294~-115，并分析了野生型p53蛋白对IBP启动子活性及其表达水平的抑制作用，明确了p53蛋白作为转录因子与IBP启动子的结合。进一步研究发现，IBP与p53之间存在有一个相互抑制的反馈环，乳腺癌细胞中IBP的高表达会通过AKT/p53途径抑制p53的表达与活性。乳腺癌中DNA损伤药物可以以p53依赖的方式抑制IBP的表达，而IBP的高表达又可以抑制顺铂诱导的细胞凋亡，其机制与p53表达水平及活性的降低以及Bcl-2家族蛋白表达失调等相关。本研究结果为阐明IBP基因转录调控机制以及进一步深入研究IBP在乳腺癌中表达的临床意义奠定了基础。