[研究背景]帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中老年人神经系统退行性疾病,临床表现为静止性震颤、进行性强直、运动迟缓和姿势异常等,其病理特征主要是PD患者黑质内多巴胺能神经元的丢失和纹状体中多巴胺含量的显著减少。PD发病机制复杂,其发展是衰老、遗传因素、自噬障碍、炎症、自身免疫机制及氧化应激等多种因素综合作用的结果。近年来对PD发病机制的研究越来越关注于免疫平衡和细胞稳态的调控,而小胶质细胞作为脑内主要的免疫细胞,其功能和活化状态是影响PD进展的一个决定性因素。最近的研究发现,自噬可通过调节小胶质细胞介导的神经炎症参与神经退行性疾病的发生发展。自噬是一种分解代谢过程,它将细胞质中异常的细胞器和蛋白质隔离,并将其输送到溶酶体中进行降解,最终使所产生的大分子再循环。Atg5(自噬相关基因5)是自噬体形成过程中必须的分子,Atg5缺失会导致自噬障碍。自噬与免疫炎症之间的相互作用及其在中枢神经系统中所扮演的角色是近年来的研究热点,自噬异常与众多神经退行性疾病的病理过程密切相关。已有文献表明小胶质细胞介导的自噬反应在缺血性脑卒中、阿尔茨海默病中发挥一定作用,但有关小胶质细胞自噬在PD进程的影响在国内外少见报道。鉴于自噬和炎症均与PD的病理生理机制密切相关,深入探讨PD病理过程中小胶质细胞自噬的作用及与神经炎症反应之间的关系具有重要的意义。在巨噬细胞中,自噬可通过负性调节免疫信号途径及NLRP3炎性小体活性发挥抗炎作用。NLRP3炎性小体是当前免疫学研究的热点之一,与多种免疫性疾病及神经退行性疾病的发病密切相关。在涉及PD发病机制的多种炎性介质中,NLRP3发挥重要作用。NLRP3是NOD样受体家族中的一员,与凋亡相关斑点样蛋白(caspase-activating-recruitment-domain,ASC)和 caspase-1 结合形成炎性体,导致caspase-1的募集和活化,然后caspase-1诱导IL-1β和IL-18的成熟和分泌。大量研究证明,巨噬细胞中自噬的丧失或损伤可导致和IL-18、IL-1α和IL-1β的过度分泌。因此,小胶质细胞中的自噬是否和NLRP3炎症反应有关值得进一步研究。基于以上研究背景,本实验通过干扰Atg5表达抑制小胶质细胞自噬,观察小胶质细胞自噬在PD中的作用以及对PD神经炎症的影响,进而研究自噬对NLRP3的激活以及下游caspase-1和IL-1β成熟和分泌的影响。[研究目的]通过利用Atg5小干扰RNA和构建小胶质细胞特异性Atg5基因敲除小鼠,在体内和体外实验中观察小胶质细胞自噬功能障碍对PD的作用,进一步研究小胶质细胞自噬是否通过NLRP3通路调控PD神经炎症。[研究方法]体内实验:1.根据Cre-loxP原理,将Atg5基因flox杂合子小鼠(Atg5flox+/-)和表达CX3CR1-Cre酶的小鼠交配,得到小胶质细胞条件性Atg5基因敲除小鼠(Atg5flox/flox;CX3CRl-Cre),进行基因型鉴定并使用流式分选出原代小胶质细胞检测敲除效率。2.取野生(Wild-type,WT)、Atg5flox/flox和 Atg5flox/flox;CX3CR1-Cre 三组小鼠黑质和纹状体部位的冰冻切片进行酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)免疫组化染色,取三组小鼠黑质的组织切片进行尼氏染色,观察未造模情况下小胶质细胞特异性敲除Atg5对多巴胺神经元的影响。3.小鼠腹腔注射MPTP构建PD急性模型,7 d后通过转棒实验,悬挂实验和爬杆实验观察不同组小鼠的行为学改变。4.小鼠腹腔注射MPTP构建PD急性模型,7d后免疫组化实验观察四组小鼠黑质和纹状切片TH的表达,取四组小鼠黑质的组织切片进行尼氏染色,以及取纹状体使用HPLC-MS联用法检测DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量,观察小胶质细胞特异性敲除Atg5对MPTP诱导的急性PD小鼠模型中脑多巴胺神经元变性的影响。5.小鼠腹腔注射MPTP构建PD急性模型,7 d后取四组小鼠黑质的组织切片对Iba1和GFAP进行免疫荧光染色,观察小胶质细胞特异性敲除Atg5对急性PD小鼠模型星形胶质细胞及小胶质细胞的活化及表达变化的影响。6.小鼠腹腔注射MPTP构建PD急性模型,选择造模后1 d、3 d、5 d、7 d四个时间点处死小鼠,取小鼠黑质部位组织,western blot检测各个时间点NLRP3的表达变化,选择7 d后取四组小鼠黑质部位组织和冰冻切片,western blot及免疫荧光检测NLRP3和TH的表达,并用western blot检测NLRP3下游caspase-1和IL-1β的活化情况。7.小鼠腹腔注射MPTP构建PD亚急性模型,21 d后进行行为学实验,免疫组化实验观察四组小鼠黑质和纹状体的切片TH的表达,并取纹状体部位的组织,western blot检测TH的表达,观察小胶质细胞特异性敲除Atg5对MPTP诱导的亚急性PD小鼠模型多巴胺神经元变性的影响。体外实验:1.BV2小胶质细胞转染Atg5-siRNA,加LPS(5μg/ml)刺激24 h后,使用real time RT-PCR和免疫荧光检测敲低Atg5对LPS诱导的小胶质细胞炎症反应的影响。2.BV2 小胶质细胞转染 Atg5-siRNA,加IL-4(20 ng/ml)刺激24 h后,使用 real time RT-PCR和免疫荧光检测敲低Atg5对IL-4诱导的小胶质细胞M2表型marker的影响。3.BV2小胶质细胞转染Atg5-siRNA,加LPS刺激24 h后,收集细胞培养上清液作为条件培养基刺激SH-SY5Y细胞,使用Tunel荧光染色检测细胞凋亡情况,CCK8检测细胞存活率,明确小胶质细胞自噬对多巴胺能神经细胞的影响。4.BV2小胶质细胞转染Atg5-siRNA,加LPS刺激22 h后再加ATP刺激2h,免疫荧光检测NLRP3的表达,western blot检测NLRP3以及下游caspase-1和IL-1β的活化情况。[实验结果]1.Atg5flox+/-小鼠和表达CX3CR1-Cre酶的工具小鼠交配可获得小胶质细胞特异性Atg5基因敲除小鼠。2.小胶质细胞特异性敲除Atg5对小鼠大脑多巴胺神经元无明显影响。3.小胶质细胞敲除特异性Atg5加重了 MPTP诱导的急性和亚急性PD模型小鼠的多巴胺能神经毒性。4.在MPTP诱导的急性PD小鼠模型中,小胶质细胞特异性敲除Atg5加重了小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。5.敲低Atg5加重了 LPS诱导的BV2细胞炎症反应。6.BV2细胞中Atg5敲低可导致SH-SY5Y细胞凋亡增多以及存活率下降。7.在MPTP诱导的急性PD小鼠模型中,小胶质细胞特异性敲除Atg5加重了NLRP3炎性小体的活化及炎症反应。8.敲低Atg5加重了 LPS和ATP诱导的BV2细胞中NLRP3小体的表达。[结论]抑制小胶质细胞自噬可加重MPTP诱导的PD模型小鼠多巴胺神经元损伤,其机制可能是通过增加NLRP3及其下游分子的表达加重PD炎症反应,从而促进PD的病理进程。