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颗粒蛋白前体（Progranulin,PGRN）是一种分泌性的糖蛋白,由593个氨基酸组成,成熟的经过糖基化修饰的蛋白分子量约为88kD,而非糖基化的蛋白分子量大约为68kD。PGRN蛋白包含N端17个氨基酸组成的分泌信号肽和其后的7个完整的及1个半完整的颗粒蛋白样结构域（granulin,GRN）,从N端开始,这些结构域依次分别被命名为paragranulin,Granulin G、F、B、A、C、D、E,不同的结构域之间通过一段多肽序列连接起来。PGRN蛋白一方面参与胚胎发育、损伤修复、炎症抑制及免疫调节、软骨发育和神经营养等多种生理过程,同时在肿瘤、肥胖、胰岛素耐受以及神经退行性疾病等多种病理过程中,也发挥着重要的作用。但目前介导PGRN生物学功能的具体作用机制仍不明确。本实验室前期通过酵母双杂交系统筛选获得一种新的与PGRN相互作用的分子FAM76B蛋白,它们的相互作用已在体外通过Co-IP、GST-Pull down和细胞共定位染色等实验得到了进一步的验证。尽管目前FAM76B的功能仍然未知,但FAM76B作为PGRN的相互作用蛋白,其生物学功能在理论上可能同PGRN的生物学功能有类似之处。因此,本课题在本实验室以往研究基础上,一方面通过体外实验探讨FAM76B在肿瘤耐药性、细胞存活能力及细胞衰老和增殖中的功能,另一方面以类似前单核细胞的U937细胞为模型探索FAM76B与PGRN在介导炎症反应中的作用机制,为深入研究PGRN功能多样性的分子机制提供一定的帮助;同时,尝试探索在不同状况下PGRN在细胞内的加工处理、分布及与FAM76B共定位的关系,并分析其在细胞内分布改变的可能机制。通过上述研究不仅可以深入了解FAM76B的生物学功能,同时也为阐明介导PGRN生物学功能的分子机制研究奠定基础。本课题具体研究内容包括以下5个方面:（1）FAM76B敲除的HEK293细胞系的建立:设计针对FAM76B的sgRNA,利用CRISPR/Cas 9系统在HEK293细胞中对FAM76B基因进行敲除,经过细胞克隆化,最后通过PCR、DNA测序和WB检测对FAM76B敲除的HEK293细胞系进行鉴定;（2）FAM76B在乳腺癌对Tamoxifen耐受作用中的功能研究:在利用表达FAM76B或PGRN的慢病毒载体建立稳定高表达FAM76B或PGRN的MCF-7细胞系的基础上,利用雌激素反应元件调控荧光素酶表达的启动子活性报告载体,一方面研究FAM76B或PGRN对雌激素的协同增强作用,另一方面研究FAM76B或PGRN对Tamoxifen雌激素拮抗作用的影响,同时检测了 FAM76B或PGRN对Tamoxifen诱导细胞凋亡过程中凋亡抑制基因Bcl-2的表达的影响。（3）FAM76B在细胞衰老及增殖中的功能研究:利用FAM76B敲除的小鼠胚胎成纤维细胞和HEK293细胞,通过衰老相关β半乳糖苷酶活性染色探索FAM76B对MEF细胞衰老的影响,通过MTT方法检测FAM76B敲除对MEF和HEK293细胞增殖的影响;（4）FAM76B对细胞存活能力的功能研究:分别采用内源性PGRN高表达的U87和SHSY5Y细胞系、外源性稳定高表达FAM76B的U87和SHSY5Y细胞系以及FAM76B敲除的HEK293细胞系,然后经不同浓度H202处理诱导细胞死亡,通过形态学观察方法和MTT方法探究FAM76B在U87和SHSY5Y细胞及HEK293细胞中对H202诱导死亡作用的影响;（5）FAM76B和PGRN在巨噬细胞介导炎症反应中的功能研究:采用外源性稳定单独高表达FAM76B或PGRN和共同高表达FAM76B和PGRN的U937细胞系,通过PMA单独或联合LPS/IFNγ或联合IL4/IL13对上述细胞系进行诱导处理,然后通过real time PCR方法检测过表达FAM76B或PGRN对IL6、TNFα、PTGS2和IL10表达的影响;同时,利用免疫荧光染色技术检测FAM76B和PGRN在PMA单独或联合LPS/IFNγ处理诱导U937细胞分化过程中的细胞定位并探索其机制,为探索FAM76B和PGRN在巨噬细胞介导炎症反应中的作用机制奠定基础。通过上述研究,本课题取得的具体结果如下:（1）在对HEK293细胞FAM76B基因进行敲除的研究中,通过PCR及DNA测序结果表明,FAM76B的两个等位基因中分别插入了不同大小的外源DNA片段,WB实验也证实,在细胞中未能检测到内源FAM76B蛋白表达,以上结果表明,成功获得FAM76B两个等位基因同时敲除的HEK293细胞系;（2）在乳腺癌MCF-7细胞中,过表达PGRN可以协同增强雌激素效应,并在一定程度抑制Tamoxifen对雌激素的拮抗作用,同时可以提高凋亡抑制基因Bcl-2的表达量,而过表达FAM76B对雌激素效应和Tamoxifen的作用无影响;（3）在小鼠胚胎成纤维细胞中,FAM76B基因的完全缺失一方面可以加快MEF细胞的衰老,另一方面可以抑制MEF细胞的增殖,而FAM76B敲除的嵌合型MEF细胞与正常MEF细胞在细胞衰老及增殖速率方面无明显差别;在HEK293细胞中,FAM76B敲除也可以明显抑制其增殖速率;（4）在U87和SHSY5Y细胞中,FAM76B过表达可以增强这两种细胞对H202诱导死亡的耐受能力,提高细胞存活率;但是在HEK293细胞中,FAM76B敲除对其在H202处理时的细胞存活率无明显影响;（5）在U937细胞中,过表达FAM76B或PGRN可以明显抑制PMA联合LPS/IFNγ诱导的促炎细胞因子IL6、TNFα和PTGS2的表达量,过表达PGRN还可以提高抑炎细胞因子IL10的表达量,但是FAM76B无此作用;同时,过表达FAM76B或PGRN对PMA联合IL4/IL13处理时的促炎细胞因子IL6、TNFα和PTGS2的表达量无改变,但是可以在一定程度降低抑炎细胞因子IL10的表达量。说明FAM76B和PGRN可以通过抑制促炎细胞因子表达和PGRN提高抑炎细胞因子表达的方式抑制炎症发生,并且该两种基因可以调节促炎细胞因子与抑炎细胞因子的表达水平的动态平衡。结合上述研究结果,通过在HEK293细胞中的进一步验证实验表明,FAM76B敲除可以提高hIL6和hPTGS2启动子活性。同时发现,过表达PGRN或FAM76B可以通过抑制Caspase 3活化和提高Bcl-2表达的方式抑制PMA联合LPS/IFNy处理对U937细胞的凋亡诱导作用;（6）利用PMA单独处理U937细胞后,内源性FAM76B除少量在细胞核中分布外,大部分定位于细胞质中,内源性PGRN除在细胞质中分布外,在细胞核中也出现类似包涵体的分布,而利用PMA联合LPS/IFNγ对单独过表达FAM76B或PGRN和同时过表达FAM76B和PGRN的U937细胞系处理后,FAM76B分布于细胞核中,而PGRN除在细胞质中分布外,在细胞核中也出现类似包涵体的分布,提示PGRN细胞分布的改变有可能介导其抑制炎症反应的功能。PMA单独处理会明显提高U937细胞中SORT1表达量,同时在经PMA联合LPS/IFN γ处理的U937细胞中,过表达FAM76B或PGRN可以明显提高SORT1基因的表达量。在HEK293细胞中,过表达SORT1会降低细胞质和细胞培养上清中的PGRN表达量,但是不会影响PGRN在细胞中的细胞质分布。说明SORT1有可能参与介导PGRN在细胞中的分布,但是其改变PGRN细胞分布的功能的发挥需要其它蛋白的协同作用。综上所述,FAM76B具有抑制细胞衰老和凋亡、促进细胞增殖和抑制炎症反应的功能,与PGRN功能非常相似。上述研究结果为进一步阐明PGRN功能发挥的分子机制提供了重要的帮助。