益生菌(Probiotic)是指对人和动植物机体有益的细菌。这类细菌具有维持动物消化道内微生物的平衡,提高饲料利用率,防治疾病的作用,还可以刺激机体免疫细胞产生多种细胞因子,调节机体的特异性和非特异性免疫应答,临床上多用于预防和治疗消化道疾病。枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌都是常用的益生菌,近年来发现枯草芽孢杆菌能影响小鼠粪便中乳酸杆菌的数量,但是对于在宿主肠道内这两种益生菌之间是否具有协同益生作用方面未见报道。本文以新生仔猪为试验对象,研究枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌对新生仔猪肠道黏膜先天性免疫功能的影响,初步探讨这两种益生菌在体内的协同刺激作用,以期为在养猪生产上的合理应用提供理论基础和试验依据。1枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌对仔猪小肠先天免疫相关细胞因子及p防御素-2mRNA表达水平的影响本试验选用40头0日龄仔猪,随机分为对照组(n=8)、商品日粮组(n=8)和三个试验组(n=24)。母乳喂养一周后,对照组和试验组开始饲喂无抗教槽料。试验组分别于0、7、11、26日龄添加枯草芽孢杆菌(1.0×109cfu/mL)、猪源乳酸杆菌(1.0×109cfu/mL)、枯草芽孢杆菌与猪源乳酸杆菌(体积比1：1)1、2、3、5mL/头；对照组同时给予等量的蔗糖溶液；商品日粮组常规饲喂至试验结束。试验期4周,自由饮水及采食。28日龄时处死仔猪,采集十二指肠和回肠等样品。应用实时荧光定量(Real-time PCR)检测十二指肠和回肠中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)三种细胞因子及β防御素-2(pBD-2)的基因表达。结果显示,饲喂枯草芽孢杆菌能显著提高十二指肠IL-6、TNF-α以及回肠IL-1β的基因表达量；饲喂猪源乳酸杆菌能显著提高十二指肠IL-1β、TNF-αpBD-2以及回肠IL-6、pBD-2的基因表达量；而同时饲喂枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌则可以显著提高十二指肠和回肠IL-1β、IL-6以及十二指肠pBD-2的基因表达量。结果提示,同时饲喂枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌能提高肠上皮细胞某些功能基因、细胞因子的表达,对肠道黏膜免疫具有积极地调节作用,从而增强宿主的防御能力。2枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌对仔猪小肠局部TLRs表达水平的影响本试验主要从基因和蛋白水平研究枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌对仔猪小肠Toll样受体-2(TLR-2)和TLR-9表达水平的影响。试验设计同上。28日龄时处死仔猪,采集十二指肠和回肠等样品。分别应用Real-time PCR和蛋白质免疫印迹(Western-blot)检测十二指肠和回肠中TLR-2和TLR-9的基因和蛋白表达水平。结果显示,饲喂枯草芽孢杆菌、猪源乳酸杆菌或同时饲喂这两种益生菌后,仔猪十二指肠TLR-2的基因和蛋白表达、回肠TLR-2的蛋白表达均显著升高；而单独饲喂猪源乳酸杆菌还能显著提高回肠TLR-9的蛋白表达。此外,同时饲喂枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌还能显著刺激十二指肠TLR-9的基因和蛋白表达以及回肠TLR-2的基因表达。结果提示,同时饲喂枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌能显著提高肠上皮细胞TLR-2和TLR-9的表达,从而直接增强免疫系统对病原微生物的清除能力,有效控制病原微生物的感染。3枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌对仔猪肠道肠绒毛及IgA分泌细胞的影响本试验主要探讨枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌对仔猪肠道肠绒毛发育及免疫球蛋白A(IgA)分泌细胞数量的影响。试验设计同上。28日龄时处死仔猪,采集十二指肠、空肠、回肠和结肠等样品。应用HE染色法检测小肠各段肠绒毛的高度、宽度和隐窝深度的变化,并用免疫组织化学方法检测十二指肠、空肠、回肠和结肠中IgA分泌细胞数量的变化。结果显示,单独饲喂枯草芽孢杆菌能显著提高回肠的肠绒毛高度、降低空肠和回肠的隐窝深度,并能提高各段肠道中IgA分泌细胞的数量；单独饲喂猪源乳酸杆菌能显著提高十二指肠和回肠的肠绒毛高度、降低空肠的隐窝深度；而同时饲喂枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌则能显著提十二指肠和回肠的肠绒毛高度,以及降低空肠和回肠的隐窝深度。此外,与对照组相比,各处理组均能显著提高十二指肠、空肠和结肠中IgA分泌细胞的数量。结果提示,枯草芽孢杆菌或猪源乳酸杆菌在仔猪肠道中定植以后,可以极大地增加小肠内壁表面积,提高吸收效率；并通过增加肠道各段IgA分泌细胞的数量提高小肠的局部体液免疫能力。4枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌拮抗大肠杆菌对仔猪肠道上皮的影响为进一步探讨枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌对仔猪肠道的抗感染作用,本部分试验在前三个试验的研究基础上,分别于32、34、36日龄给同时饲喂了枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌的仔猪接种大肠杆菌K88(E. coli K88),38日龄时颈静脉放血处死后,采样保存。应用HE染色法观察枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌拮抗大肠杆菌对仔猪肠道上皮形态的影响。试验结果表明,同时饲喂枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌能有效地拮抗大肠杆菌对仔猪肠道的感染,其肠道上皮细胞排列整齐、形态结构正常,没有出现炎性细胞浸润。这提示枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌可以作为益生素添加到动物饲料中,起到预防和治疗仔猪腹泻的目的。