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目的:构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统(TCS)基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。建立肺炎链球菌comD基因敲除突变株,了解comD基因与细菌β-内酰类抗生素耐药性的相关性,探讨氯氰碘柳胺下调comD、comE和comC基因mRNA的作用。
方法:采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量。免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清。检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化。构建用于comD基因敲除的自杀质粒pEVP3comD,通过同源重组及插入失活获得肺炎链球菌ATCC6306株comD基因敲除突变株coreD-。采用PCR及免疫荧光法对comD-突变株进行鉴定。采用实时荧光定量RT-PCR检测氯氰碘柳胺处理前后comD-突变株及野生株comD、comE和comC基因mRNA水平变化。采用二倍琼脂稀释法测定comD-突变株及野生株对青霉素G和头孢噻肟的敏感性。
结果:与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4％～99.3％和99.1％～100％。所构建的工程菌E.coliBL21DE3pET42a-comD、E.coliBL21DE3pET42-comE和E.coliBL21DE3pET32a-comC能有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28％、25％和35％。rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1:4、1:4和1:8。ComD和/或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。测序及免疫荧光试验结果证实,所构建的comD-突变株染色体DNA中comD基因被插入失活。50μmol/L或100μmol/L的氯氰碘柳胺能明显下调comD、comE和comC基因mRNA水平(P＜0.05),25μmol/L的氯氰碘柳胺则否。comD-突变株对青霉素及头孢噻肟MIC值均为32μg/mL,明显高于野生株的0.06和1μg/mL。
结论:本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础。ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关。成功地构建了肺炎链球菌comD基因敲除突变株。comD基因与细菌对β-内酰类抗生素耐药性密切相关。氯氰碘柳胺可通过下调comD,comE和comC基因的转录水平,从而对细菌感受态形成产生影响。