【摘 要】
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第一部分:DISC1对癫痫后成年雄性小鼠海马区神经元迁移的影响[目的]1.探究DISC1蛋白在癫痫小鼠海马齿状回区的调控作用;2.阐明癫痫后DISC1与 Reelin、ApoER2、EphB2、Integrinβ1、Integrinα5的表达变化及其相互关系。[方法]选取SPF级健康成年雄性C57BL/6小鼠（4-6周龄,18-22g）,采用腹腔注射匹罗卡品（260-275mg/kg）构建自发性痫
【基金项目】
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DISCI通过AKT-mTOR、Reelin通路调控癫痫后齿状回新生神经元迁移的机制研究。国家自然科学青年科学基金（编号:81601134）； 云南省高层次卫生健康技术人才医学学科后备人才项目（H-2018056）；
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第一部分:DISC1对癫痫后成年雄性小鼠海马区神经元迁移的影响[目的]1.探究DISC1蛋白在癫痫小鼠海马齿状回区的调控作用;2.阐明癫痫后DISC1与 Reelin、ApoER2、EphB2、Integrinβ1、Integrinα5的表达变化及其相互关系。[方法]选取SPF级健康成年雄性C57BL/6小鼠（4-6周龄,18-22g）,采用腹腔注射匹罗卡品（260-275mg/kg）构建自发性痫性发作小鼠模型,按照改良Racine分级选取发作级别在4级及以上的小鼠入组;腹腔注射等量生理盐水构建对照组,在造模成功后1周、2周、4周、8周取材并进行以下检测:（1）免疫荧光双标:观察DISC1与神经细胞生长发育过程中不同时期的标记物蛋白（DCX、Proxl、GFAP、NeuN、BLBP和Nestin）的共表达情况;观察DISC1分别与Reelin、EphB2、Integrin β1、Integrin α5 的共表达情况;（2）Western Blot:检测癫痫后各个时间点 DISC1、Reelin、ApoER2、EphB2、Integrin β1 和 Integrin α5 等蛋白在海马中的相对表达变化;（3）Realtime PCR:检测癫痫后各个时间点DISC1、Reelin、ApoER2、EphB2、Integrin β1 和 Integrinα5 mRNA 在海马中的相对表达变化。[结果]1.癫痫造模成功率为89%,死亡率为45%,造模全程小鼠死亡高峰期在注射匹罗卡品后1周内;2.在癫痫小鼠海马的门区（Hilus区）中可见:①GFAP+细胞对DISC1+细胞的“环抱”现象;②DISC1与BLBP、Nestin、Prox1和NeuN均有共表达;3.Western Blot和Realtime PCR显示癫痫后DISC1表达下调,且与Reelin、ApoER2、EphB2蛋白和mRNA均呈现出与之相似的表达趋势;而Integrin β1和Integrin α5蛋白和mRNA表达则呈现出与DISC1相反的表达趋势;4.免疫荧光结果显示在癫痫小鼠海马Hilus区,DISC1与Reelin、EphB2、Integrin β1、Integrin α5均有共表达。[结论]1.DISC1可能对癫痫后神经元的异常新生具有调控作用。2.DISC1对癫痫后海马区神经元迁移的调控作用与Reelin-ApoER2/EphB2、Reelin-Integrin α5/β1信号通路均具有相关性。第二部分:DISC1对癫痫后成年雄性小鼠海马区神经元迁移的调控机制[目的]探索 DISC1 通过 Reelin-ApoER2/EphB2 以及 Reelin-Integrin β1/Integrin α5信号通路在癫痫后海马区新生神经元迁移中的作用机制。[方法]癫痫造模同第一部分。在造模成功后一周,采用小鼠脑立体定位技术,随机将小鼠分为过表达组、阴性对照组和阴性对照+绿色荧光组,分别于双侧海马注射（HBAAV2/9-Tal-m-Discl-3xflag-Null、HBAAV2/9-Tal-Null和HBAAV2/9-Tal-ZsGreen）,2μl/侧,于注射腺相关病毒后3周、6周取材并进行以下检测:（1）Western Blot:检测转染后各个时间点 DISC1 蛋白、Reelin、ApoER2、EphB2、Integrin β1以及Integrin α5蛋白的相对表达变化;（2）Realtime PCR检测:检测转染后各个时间点 DISC1、Reelin、ApoER2、EphB2、Integrin β1 以及 Integrinα5 mRNA的相对表达变化;（3）免疫荧光双标:观察DISC1分别与Reelin、EphB2、Integrin β1、Integrin α5的共表达情况。[结果]1.腺相关病毒的齿状回转染成功率为99%。注射腺相关病毒后的小鼠死亡率为14%;2.Western Blot和Realtime PCR结果显示:腺病毒单基因干预能够成功上调海马区DISC1蛋白和mRNA的表达;3.DISC1表达上调后,Reelin、ApoER2、EphB2的蛋白及其mRNA的表达也显著增加,而Integrin β1和Integrin α5表达则明显降低;4.免疫荧光结果显示:DISC1表达上调后,DISC1与EphB2在Hilus区共表达的细胞数目显著增加。[结论]1.DISC1通过Reelin-ApoER2/EphB2信号通路对癫痫后的神经元异常迁移起到负向调控作用。2.DISC1可能通过Reelin-Integrin α5/β1信号通路对癫痫后海马区神经元新生起到调控作用。
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