背景与目的β地中海贫血（βthalassemia，简称β地贫）[MIM 141900]是世界上最常见的单基因遗传病之一，β地贫的地理分布主要在全球的热带和亚热带疟疾高发地区，包括北非、地中海地区、中东、印度次大陆、东南亚和中国南方。该病在我国南方高发区人群中基因携带者频率为0．5-6％，其中，尤以广西、广东和海南三省（区）为甚，这些地区人群中的重型β地贫（包括中间型地贫）的发生率估计为0．4‰。虽然β地贫在中国南方非常常见，但是不同地区和不同民族的地贫突变谱有待进一步确定，特别是一些少见的导致β地贫的基因突变的鉴定。完善我国南方人群β地贫突变谱对于指导临床诊断和遗传咨询，以及制订有效的人群预防计划有重要意义。β地贫通常被认为是一种常染色体隐性遗传性疾病，即β珠蛋白基因纯合子或双重杂合子才能导致发病。然而，由β珠蛋白基因突变杂合子导致的显性遗传性β地贫少见病例已经在多个种族人群中发现，例如β地贫显性突变在英国人，意大利人，法国人，捷克人，西班牙人，朝鲜人和日本人中均有报道。显性遗传性β地贫主要是由β珠蛋白基因的移码突变，错义突变和无义突变所引起。目前已经报道的突变共有40种。其中，有29种位于外显子3，7种位于外显子2，其余的位于外显子1以及外显子内含子剪接区。显性遗传性β地贫的临床表现变异很大，从轻微的临床症状到输血依赖的症状皆可以存在。我们在贵州省β地贫突变筛查的过程中，在一个苗族家系中鉴定出了一个引起显性遗传性β地贫的新移码突变-cd53（-T），以及二个新的RFLP单倍型。在家系分析的基础上，通过实时荧光定量反转录PCR技术，我们在mRNA水平上分析了这一新突变对基因转录效应的影响。材料与方法先证者是一名22岁的年轻女性，有典型的贫血面容，皮肤黄染，腹部触诊有肝脏肿大，没有输血史。先证者和她全部的家庭成员（53人，3代）均为世居于我国贵州省安顺地区的苗族人。先证者的血常规检查显示有小细胞低色素贫血症，Hb含量9．9g／dl，MCV及MCH减低，HbA2增高。利用反向点杂交技术筛查中国人已知的24种β地贫点突变，未见阳性结果。在签署知情同意书后，我们对先证者及其17位家庭成员进行了家系调查。在这17位家庭成员中，有6人是先证者的一级亲属，有11人是先证者的二级亲属。其余家庭成员由于各种原因没有参与此次研究。采用酚／氯仿法提取样品的外周血基因组DNA。反向点杂交技术用于中国人已知的24种β地贫点突变的基因分型。Gap-PCR技术用于中国人已知的3种常见α地贫缺失突变(--^SEA／，-α^3.7／和-α^4.2／)分析；反向点杂交技术用于中国人已知的6种α地贫点突变(α^cd30α／，α^cd31α／，α^cd59α／，α^QSα／，α^CSα／和α^WSα／)的诊断。这9种突变占到已知中国人α地贫突变的98％。为了评价β地贫新突变对β珠蛋白基因表达水平的影响，我们设计了实时荧光定量反转录PCR实验，采用基于双标准曲线法的定量分析，我们对该家系的6名新突变携带者和6名正常人的mRNA进行了基因表达水平检测。并应用独立样本t检验来分析突变组和正常对照组之间，平均mRNA相对含量的差异。为了调查新突变的分子遗传学背景，我们选择了β珠蛋白基因簇上7个经典的限制性酶切位点（即HincⅡ-5’ε，HindⅢ-Gγ，HindⅢ-Aγ，HincⅡ-Ψβ，HincⅡ-3’Ψβ，AvaⅡ—β和Bam HI-3’β），用于构建基于PCR的β珠蛋白基因RFLP单倍型。结果与讨论通过PCR扩增先证者及其家系成员β珠蛋白基因全长片断，并对PCR产物直接进行DNA序列测定分析，我们发现，在先证者及其6个表型阳性的家庭成员中，均存在同一种突变一cd53（-T）。在PubMed上进行文献检索，以及查询珠蛋白基因服务网站（http：／／globin．cse．psu．edu／），均未发现此突变类型。证实此突变是世界首报的β地贫突变类型，也是中国人人群中第一次报道的显性遗传性β地贫病例。通过观察53人的家系图谱，可见每一名β地贫患者的父母中，只有一方受累。而且中间型β地贫的症状出现于家系中的每一代。该家系谱特征符合常染色体显性遗传传递方式。通过基因分析，该家系排除了合并中国人主要己知α地贫突变的可能性；实时定量反转录PCR分析显示病例组与对照组的β珠蛋白基因表达水平无显著差异。目前，全世界发现了40种可以引起显性遗传性B地贫基因突变。在分子水平上，其遗传缺陷有如下4种类型：①错义突变；②完整密码子的缺失或插入；③无义突变；④产生带有异常羧基端的延长或截短蛋白的移码突变和异常剪切点突变。目前已报道4种位于β珠蛋白基因第二外显子上的移码突变可以引起显性遗传性β地贫。这4种突变为：cd91（-T），cd94（+TG），cd100（-CTT，+TCTGAGAACTT）和cd104 （-G），分别导致含有156，156，158和156个氨基酸的延长的β珠蛋白变异体产生。由于cd53（-T）导致含有59个氨基酸的β珠蛋白变异体，所以这是第一个位于第二外显子上的导致截短的β珠蛋白变异体并引起显性遗传性β地贫的移码突变。β珠蛋白基因cd53缺失碱基T，导致在其下游19bp处出现了一个不成熟的终止密码子（PTC）。大多数的无义突变和移码突变可以触发无义介导的mRNA降解（NMD），来清除含有PTC的mRNA。然而，本研究提示该位于β珠蛋白基因第二外显子的移码突变并非通过显著降低mRNA转录水平来引起疾病。可能的原因是“NMD抵抗”在发挥作用。如果突变与下游的AUG密码子足够接近的话，翻译再起始的机制就能够消除NMD的作用。这一理论已经在磷酸丙糖异构酶基因和β珠蛋白基因中进行过闸述。既然在密码子73／74处也有一个AUG，那么翻译再起始的机制也就同样可以解释cd53（-T）的“NMD抵抗”作用。异常的β珠蛋白mRNA可以翻译产生大量截短的β珠蛋白，它们和富余的α珠蛋白同时沉积在红细胞内，导致红细胞的无效生成。这一机制可以解释cd53（-T）突变携带者所表现出的中间型β地贫的表型。进一步的研究还需要阐明cd53（-T）突变产生的异常mRNA的稳定性以及翻译情况的分子生物学基础。苗族是中国的第四大少数民族，人口有894万。其中有一半居住在贵州省，其余分布在中国南方的几个其他省份。由于历史上苗民族的长期迁移，在越南，泰国，老挝，美国，加拿大，法国和澳大利亚，也有300多万的人口分布。我国苗族的β地贫的携带者率仍在调查之中，本研究是首次在这一民族中发现新的β珠蛋白基因突变。因为大部分的苗族人口居住在地贫高发的地区，所以针对大量人口进行的地贫发病率和突变谱的研究，对以社区为基础的地贫预防计划的制订有重要价值。除了新突变cd53（-T），我们还鉴定出两个新的β珠蛋白基因单倍型，即Miao A“----+-+”和Miao B“--+++-+”。单倍型Miao A存在于所有的7个新突变的携带者中，与cd53（-T）连锁遗传。单倍型Miao B只存在于一个家庭成员之中，是由其母亲传递而来。苗族人口β珠蛋白基因单倍型的新知识，将有助于对基因流，人群亲缘关系和种族起源的研究。