玉米纹枯病是由担子菌类真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)引起的对玉米品质和产量具有重要影响的病害,而且立枯丝核菌R. solani同时是水稻纹枯病和马铃薯立枯丝核菌病的病原。除此之外,许多其他的重要的农业作物同样是它的寄主。尽管已经发现许多抗立枯丝核菌的QTL (quantitative trait locus)位点,但是基于立枯丝核菌的死体营养的特性,目前在任何立枯丝核菌的寄主中都没有发现有效的抗病基因。病原物蛋白质与寄主蛋白质之间的互作在病原物侵染寄主的最初阶段起到了十分关键作用,病原物与寄主接触表面的蛋白质和其他信号分子构成了寄主-病原物相互识别的基础。在研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用方面酵母双杂交已经被证明是一种强有力和重要的手段。本实验基于Clontech酵母双杂交系统和大规模酵母双杂交筛选思路,建立了一种新的酵母双杂交筛选策略。在本实验中,R. solani的cDNA群体和pGBKT7载体(含DNA-binding domain)融合构成小容量的“钓饵”群体,通过一次杂交操作筛选与玉米cDNA-pGADT7载体(含activation domain)构成的cDNA文库存在的相互作用。我们的实验结果表明这种方法可以通过一次杂交筛选多个“钓饵”的互作蛋白质,从而避免了之前大规模酵母双杂交方法中克隆多条开放阅读框分别作为“钓饵”,每个“钓饵”都进行一次酵母双杂交的繁琐操作,而且使用cDNA作为“钓饵”而不是完整的ORF使得这种方法可以应用于像纹枯菌这样基因组信息未知的生物体内蛋白质网络的构建或者病原物-寄主之间蛋白质相互作用的筛选。本研究分别提取了纹枯病菌总RNA和接病的玉米总RNA,纯化得到mRNA,分别反转录得到可以和载体pGBKT7、pGADT7同源重组的的cDNA;其中纹枯菌cDNA群体和载体pGBKT7融合转化酵母Y2HGold作为“钓饵”群体,得到6400个单克隆,纹枯菌cDNA群体的重组率为66.7%；玉米cDNA文库和pGADT7载体融合转化酵母Y187,所得的酵母文库滴度为2.00×107pfu/ml,重组率为94.7%。通过平板影印的方法去除了自激活的包含纹枯菌cDNA的酵母单克隆,非自激活的单克隆重新收集混合,与玉米cDNA文库杂交筛选互作蛋白质。将经过两轮缺陷培养基SD/-Leu/-Trp/X/A和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X/A的筛选得到的约400个阳性酵母克隆,提取质粒,以BD Forward PCR Primer, BD Reverse PCR primer引物扩增阳性克隆的pGBKT7载体插入片段,AD Forward PCR Primer, AD Reverse PCR primer引物扩增阳性克隆的pGADT7载体插入片段,去除空载体、PCR鉴定和转化大肠杆菌DH5a过程中损失的无效阳性克隆最终获得92个有效的阳性克隆,将这些转入大肠杆菌DH5a中的阳性克隆质粒送往公司测序。运用DNAStar批量去除载体冗余序列,Clustal X2对测序结果批量比对去除重复序列,最终获得36个不同的阳性克隆,包括了34个不同的纹枯菌cDNA片段和36个不同的玉米cDNA片段。运用BLAST2GO (http://www.blast2go.org)在线分析工具分别对34条纹枯菌cDNA序列和36条玉米cDNA序列进行blastx, blastn比对、保守结构域、生物学功能等进行了批量的分析。Blastx表明34个不同的纹枯菌cDNA最佳匹配结果全部是纹枯菌蛋白质,将这些匹配蛋白质全序列下载到本地,运用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)进行保守结构域和信号肽的分析,最终得到了8条含有信号肽的纹枯菌蛋白质,分别为Zn(2)-Cys(6)类锌指蛋白,乙二醛酶／博来霉素抗性蛋白／双加氧酶家族蛋白,包含激酶结构域的蛋白,丝氨酸蛋白酶,包含Cu/Zn超氧化物歧化酶结构域的蛋白质,含有类F-box结构域的蛋白质,包含海藻酸裂解酶结构域的蛋白以及一种未知的假定蛋白。这些蛋白质具有典型的分泌信号肽,可能是纹枯菌的分泌蛋白,在纹枯菌侵染玉米的过程中可能具有一定的生物学功能,具有深入研究的价值。本实验筛选到了一些纹枯菌潜在的分泌蛋白以及它们可能的在玉米中的受体蛋白,实验结果为深入研究纹枯病菌与寄主玉米的互作机制找到了一些切入点,将有助于进一步研究纹枯病菌的致病机理和玉米的抗性机制,从而为今后抗纹枯病育种奠定基础。