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研究背景支气管哮喘是一种以气道高反应性和慢性气道炎症为主要特征的变态反应性疾病,其发病机制尚未完全明了。较统一的观点认为哮喘是多种细胞如上皮细胞、成纤维细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞引起的慢性气道炎症。支气管痉挛、黏膜水肿、黏液分泌物充满气道是哮喘患者急性发作的一个重要环节。在哮喘炎症中T淋巴细胞发挥着重要的免疫调节作用,Th2占优势的Th1/Th2失衡是哮喘发病的一个重要机制,Th2细胞分泌细胞因子IL-4、IL-13、IL-5和IL-9,其中IL-4和IL-13促使B细胞生产IgE,IL-5促进骨髓嗜酸性粒细胞的分化,IL-9能趋化肥大细胞并引起肥大细胞的分化,这些细胞因子在哮喘发病中发挥重要作用。但是,这个理论并不能完全解释哮喘全部的病理生理过程。新近研究发现,机体存在一种新型的不同于1型和2型的效应T细胞—辅助性17细胞（T help 17,Th17）亚群。该细胞是由天然T细胞前体Th0分化而来,具有与Th1和Th2细胞不同的独立的分化和发育调节机制,其在促炎症反应和自身免疫性疾病中发挥着重要作用。该细胞亚群能够特异性地产生效应因子白细胞介素（IL）-17,而不产生IFN-γ,和IL-4,因此被称为Th17亚群。由于具有促炎性作用,也被称为炎症性T细胞（inflammatory T cell）。Th17细胞亚群的分化和功能均受Th1和Th2细胞因子的调控。IL-6和转化生长因子B（TGF-β）联合作用能诱导初始T细胞分化成Th17细胞,提示后者在哮喘等炎症性疾病中同样具有一定作用。IL-17A是IL-17家族的一个特殊亚型,由Th17细胞亚群特异性产生,IL-17A由含有一个N-末端信号肽的155个氨基酸组成并由二硫键连接的同型二聚体糖蛋白。作为一种前炎症因子,IL-17A可以诱导气道上皮细胞及成纤维细胞增加表达多种细胞因子,如IL-6,IL-8,G-CSF,GM-CSF及粒细胞趋化蛋白-2（GCP-2）,共同催化多种炎症细胞在气道内浸润,这些细胞相互作用又可以分泌多种炎症细胞因子,构成炎症细胞及炎症因子之间的复杂网络,从而形成气道的慢性炎症。但对IL-17A及Th17细胞在哮喘发病中作用机制的了解还不多,本研究拟通过小鼠哮喘模型观察Th17细胞和Th17细胞特异性产生的IL-17A在体内的表达情况,初步探索Th17细胞和IL-17A在哮喘发病机制中的作用。第一部分小鼠哮喘模型的建立目的探讨建立OVA致敏和激发的BALB/c小鼠哮喘模型。方法SPF级雌性BALB/c小鼠（南方医科大学实验动物中心）24只,4-6周龄,体重18～20g,随机分为2组,每组12只,A组为正常对照组,B组为哮喘模型组。B组小鼠于实验流程第0、14d给予腹腔注射含OVA 2mg和乳化的氢氧化铝5mg的生理盐水混悬液200μl致敏;第21d开始先给予1%OVA生理盐水200μl滴鼻激发,随后给予2%OVA生理盐水雾化液40ml经超声雾化器雾化吸入,每天1次,每次持续约40min,连续6d。A组以生理盐水代替致敏液及雾化液,方法同B组。在最后一次激发1h后,摘取小鼠眼球放血后将其颈椎脱臼处死,两组小鼠各随机选取6只行支气管肺泡灌洗术。将回收的BALF涂片,固定,HE染色,光学显微镜下进行细胞总数和分类的计数。细胞分类至少计数400个细胞,求出各类细胞所占百分比。两组小鼠各各随机选取6只行开胸取肺组织,置于10%中性甲醛固定液中固定。常规取材、脱水、石蜡包埋、制备石蜡切片、HE染色。中性树胶封片,光学显微镜下观察组织形态、气道上皮损伤、气管及血管周围嗜酸性粒细胞浸润情况,拍片。结果1.激发过程小鼠行为学观察:模型组小鼠出现不同程度的头面部瘙痒,前肢搔鼻,烦躁不安,然后俯伏不动,口唇紫绀,呼吸急促,腹肌抽搐,二便失禁等症状;而正常组小鼠无此症状。2.BALF中细胞总数和分类比较:①BALF细胞总数:A组BALF细胞总数为（0.62+0.43）×105/ml,B组BALF细胞总数为（1.41士0.13）×105/ml,B组BALF细胞总数显著高于A组（P＜0.01）。②BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率:A组BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率分别为0.83%±1.18%和5.67%±1.42%,B组BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率分别为和25.42%±4.05%和29.63%±4.91%,B组BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率显著高于A组（P＜0.01）。3.市组织病理观察结果:哮喘模型组支气管及血管周围大量炎性细胞浸润,肺间质及肺泡腔内可见中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润,气道上皮损伤,结构紊乱,气道内杯状细胞肥大增生,气道内分泌大量黏液并有粘液栓形成,粘膜下胶原纤维沉积。对照组肺组织气道结构清晰,气道纤毛上皮排列整齐,无明显的炎症改变及胶原纤维沉积。结论BALB/c小鼠经OVA和乳化的氢氧化铝腹腔注射致敏后,采用滴鼻联合雾化激发的方法成功建立小鼠哮喘模型,更加符合哮喘气道的病理生理改变。第二部分Th17细胞在哮喘发病中作用机制的研究目的初步探索Th17细胞在哮喘发病中的作用机制。方法30只SPF级雌性BALB/c小鼠随机均分为2组,每组15只,A组为正常对照组,B组为哮喘模型组。哮喘模型的制作过程同第一部分内容。观察2组小鼠BALF中细胞比例变化和气道病理改变;外周血通过摘眼球采取,肝素化处理,胸腺及肺组织用眼科剪剪成小块后,筛网上研磨成单个细胞,制作单细胞悬液,在外周血、胸腺细胞悬液和肺组织细胞悬液中分别加入适当的莫能菌素液,置于5%的CO2、37℃孵育箱培养5h,经过红细胞裂解、多聚甲醛固定、皂素破膜等处理后,加入抗小鼠的FITC-CD4和PE-IL-17A抗体行细胞表面及胞内抗原染色,最后加0.5ml染色液重悬细胞,流式细胞术检测外周血、胸腺和肺组织中Th17细胞。结果哮喘组BALF细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞百分率均显著高于对照组（P＜0.01）。病理观察可见哮喘组小鼠的气道炎症以中性粒细胞及嗜酸性粒细胞浸润为主,而对照组无此变化。哮喘组外周血、脾脏及胸腺中Th17细胞（分别为3.62%±0.58%、4.22%±0.69%、6.96%±1.35%）显著增高,与对照组（分别为0.68%±0.26%、0.76%±0.31%、0.80%±0.30%）比较有显著性差异（P＜0.01）;而肺组织中Th17细胞很少,哮喘组（0.64%±0.30%）与对照组（0.55%±0.23%）相比无统计学差异（P＞0.05）。哮喘模型组血浆中Th17的水平与BALF中嗜中性粒细胞及嗜酸性粒细胞呈正相关（分别为r=0.933,P=0.007:r=0.861,P=0.028）。结论Th17细胞参与了哮喘的发病机制,在哮喘中的作用可能是在胸腺分化成熟后,通过胸腺组织释放入外周血及其它组织中,并且外周血Th17细胞与气道嗜酸性粒细胞及中性粒细胞呈正相关,从而参与哮喘气道炎症的发生,对哮喘发病机制进行了补充和完善。第三部分白介素-17A在哮喘小鼠中的表达及意义目的初步探讨哮喘小鼠中血清白介素（IL）-17A的水平及在其在肺、脾及胸腺组织中的表达情况。方法28只BALB/c雌性SPF级小鼠随机分为正常对照组（A组,14只）和哮喘模型组（B组,14只）,哮喘模型的制作过程同第一部分内容。观察两组小鼠气道病理改变及BALF中各组细胞比例的变化;外周血通过摘眼球采取,肝素化处理,肺、脾及胸腺组织用眼科剪剪成小块后,筛网上研磨成匀浆,外周血及肺、脾、胸腺组织悬液分别置于5%的CO2、37℃孵育箱培养24h后,以3000r/min离心10min,将上清液保存在—20℃冰箱用作IL-17A的测定。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测两组小鼠血清IL-17A水平及肺、脾和胸腺组织匀浆预孵后的表达情况。结果B组BALF细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞百分率均显著高于A组（P＜0.01）。病理观察可见B组小鼠的气道炎症以中性粒细胞及嗜酸性粒细胞浸润为主,而A组无此变化。IL-17A在A组小鼠血清及肺、脾、胸腺组织匀浆中的浓度分别为10.94±5.02（×10pg/ml）,13.63±4.07（×10pg/g）,16.37±9.85（×10pg/g）,22.45±10.89（×10pg/g）,IL-17A在B组小鼠血清及肺、脾、胸腺组织匀浆中的浓度分别为52.23±19.08（×10pg/ml）,52.98±10.81（×10pg/g）.54.77±10.80（×10pg/g）,86.68±10.29（×10pg/g）。IL-17A在B组小鼠血清及肺、脾、胸腺组织匀浆中的表达水平显著增高,与A组相比差异均有显著性意义（P＜0.01）。B组肺组织中IL-17A水平与BALF中中性粒细胞和嗜酸性粒细胞呈正相关（分别为r=0.832,P=0.040;r=0.856,P=0.030）。结论IL-17A在哮喘小鼠血清及肺、脾及胸腺组织中高表达,并且肺组织IL-17A与哮喘气道中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞呈正相关,IL-17A可能是参与支气管哮喘急性发作的主要细胞因子之一,在哮喘中的作用与其促进中性粒细胞及嗜酸性粒细胞在气道内聚集有关,从而参与哮喘气道炎症。