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背景及目的结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,目前以手术为主,辅以化疗等综合治疗仍是治疗结肠癌的主要手段,但其疗效目前处于相对停滞状态,因此期待在基础研究中找到新的突破点,尽快提高疗效。缺氧是实体肿瘤中存在的一种普遍现象,缺氧诱导因子2α(HIF-2α)是肿瘤缺氧应答反应中重要的调节因子之一,研究表明HIF-2α基因在肿瘤增殖、代谢、转移、血管生成中有重要作用,而HIF-2α的调节作用机制尚不明确。本研究拟构建HIF-2α基因RNA干扰慢病毒载体,并转染293T细胞后筛靶。为进一步观察HIF-2α基因RNAi慢病毒载体在结肠癌细胞株中的表达,深入研究HIF-2α基因在缺氧微环境中的作用及调节机制做前期的准备工作。方法1:HIF-2αRNA干扰慢病毒载体的构建根据HIF-2α基因序列,按照RNA干扰序列设计原则,设计多个RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA oligo,通过酶切连接构建HIF-2α基因RNA干扰慢病毒载体。然后对HIF-2αRNAi慢病毒载体进行DNA测序。2:HIF-2α过表达载体的构建从含有HIF-2α的质粒克隆模板中获取HIF-2α,将HIF-2α与目的载体分别进行酶切、连接构建HIF-2α过表达质粒载体,DNA测序HIF-2α过表达载体。3:RNA干扰有效靶点的筛选及鉴定将构建的HIF-2α过表达载体和携带不同RNA干扰靶点序列的HIF-2α基因RNA干扰慢病毒载体,共转染培养好的293T细胞,转染24h后荧光显微镜下观测转染效果,转染36h后收集细胞抽提蛋白,采用Western blot检测目的蛋白的表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果。结果DNA序列分析和筛靶验证显示HIF-2α基因RNA干扰慢病毒载体构建正确,Western Blot显示对目的基因HIF-2α的表达有显著敲减作用。结论成功构建了HIF-2α基因RNA干扰慢病毒载体。