肿瘤相关基因ST13、MK和PLK1转录调控的研究

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肿瘤是多个因素共同作用于组织细胞,使这部分组织细胞失去机体控制,转化为对机体正常生命现象不利的严重疾病,已经了解到它的发生、发展是内外因素共同作用的结果,外在生物、物理、化学致病因素通过内在的免疫、基因等因素,在不同的个体表现差异。内外因素作用的一个重要途径,就是使肿瘤相关基因异常表达。与肿瘤相关的基因分为两大类:癌基因和抑癌基因,癌基因与肿瘤正相关,抑癌基因则与肿瘤负相关,癌基因的活化与抑癌基因的失活,往往成为肿瘤发生、发展的重要因素。基因以表达的蛋白质形式发挥作用,从基因到蛋白遵循着中心法则,要经过转录和翻译两个环节,转录复杂而精细,由转录起始、延伸、终止和mRNA丰度调节等几个步骤完成从DNA到mRNA的过程,转录起始和mRNA丰度调节尤为重要,是影响基因表达的关键步骤,直接关系到基因功能的发挥。从这两个方面对肿瘤相关基因研究,有可能了解基因的表达情况,认识肿瘤相关基因的意义,据此找到新的肿瘤诊治方法。 ST13(Suppression of Tumorigenicity 13)基因、MK(Midkine)基因和PLK1(polo-like kinase 1)基因是近来发现的新基因,目前的研究表明它们与某些肿瘤关系密切,表达水平影响着肿瘤的发生、发展。本文将从转录起始方面探索 浙江大学博士研究生论文ST13基因转录起始区的功能特征,及其对基因表达的影响。在mRNA丰度调节方面,通过siRNA(small interferenee RNA)knoek一down袱和PLKI基因表达,了解特异化学合成小干扰RNA(SIRNA)在转录调控方面的作用,及其抗肿瘤的生物学意义。 方法与结果 第一部分:肿瘤相关ST13基因5’端启动区功能研究 根据GeneBank上公布的ST13基因全序列,查找5’端非编码区序列,运用生物信息软件分析可能的功能碱基序列片段,发现以第一个外显子5’端为转录起始位点的669bp。595一+74)序列中,含有两个CpG岛,分别是206bp介179一+28)和271bp(一540一270),整个片段含有以SPI为主的65个转录因子结合位点,未发现TATA框。 在此基础上结合已有的研究成果,分别从5’端和3’端两个方向设计缺失系列碱基序列引物,以PGLZ一Bas ic一1894为模板进行PCR扩增,电泳割胶回收目的片段,与pGEM一T Easy载体进行TA克隆,限制性内切酶消化鉴定阳性克隆,测序分析,目的片段与PGLZ系列报告载体亚克隆成pGLZ系列报告重组分子,经限制性内切酶消化验证,构建了系列ST13基因碱基序列缺失片段与pGLZ系列报告载体重组的瞬间表达质粒。 提取纯化瞬间表达质粒和内参照pSV一旦一Galactosidase质粒,定量,用脂质体共同转染SW620细胞,48小时后,裂解细胞取上清,分别测试荧光素酶与半乳糖昔酶活性,以半乳糖营酶的表达校正荧光素酶的活性,比较ST13基因不同大小碱基序列片段,对下游报告基因荧光素酶表达的作用,发现669bp(一595~+74)序列为含有增强子的转录启动区。 用实时定量PCR(Real一Time PCR,RT一PCR)法分析Beap一37、SMMC一7721和SW620细胞株中ST13基因的表达情况,并用Western Blot法测试了这三株细胞中的ST13蛋白表达,ST13基因在mRNA水平呈现Beap一37>SMMC一7721)SW620,表达水平均较 渐扛大学俘士研宪生伦文高,而蛋白水平表达则看不出差异。 构建的瞬间表达重组质粒pGLZ一Bas ie一669,转染Beap一37、SMMC一7721和Sw620细胞,检测荧光素酶活性,发现重组质粒pGLZ一Bas ic一669在SW62O细胞中的表达活性,要明显高于其它两株细胞。 第二部分siRNA knock一do肋袱基因表达证NA的研究 提取肝细胞癌SMMC一7721细胞株中的总RNA,测定浓度,逆转录成cDNA,利用荧光标记探针,以GAPDH基因cDNA为内参照,在同一PCR反应体系中,Real一TimePCR(RT一PCR)观测GAPDH基因和MK基因的cDNA扩增过程,选定适当的参数,采集CT值,用GAPDH的表达相对定量MK的表达,建立了基因表达相对定量PCR方法。 设计化学合成针对MK基因表达mRNA的6种特异SIRNA双链,经脂质体转染SMMC一7721细胞,处理一定时间后,提取总RNA逆转录成cDNA,RT一PCR检测,以内参照GAPDH基因的表达相对定量MK基因表达的mRNA,处理组对比空白对照,发现6种75nM的siRNA作用48小时后,均敲除了MK基因表达的50%以上,其中MDKZ、MDK3和MDKS三组敲除mRNA达97%以上,浓度、时间曲线表明,这三种51 RNA在1 onM处48小时达到较理想的作用效果,敲除了MK基因表达mRNA的70%以上。 按照以上条件,用细胞制片染色、流式细胞计数、DNA电泳,均未发现S朋C一7721细胞在细胞周期、凋亡方面的改变。 用RT一PCR法分析37例大肠癌临床样本,发现27例明显降低,10例变化无统计学意义。 第三部分siRNA knoek do,ns贾480细胞中PLKI基因表达的研究 50nM浓度的10种化学合成的特异性PLKI基因SIRNA,经质脂体转染SW480细胞,作用24小时后,RT一PCR检测,均敲除了PLKI基因表达mRNA达25%以上,其中Pl、P4和Pg三种siRNA在80%以上
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