论文部分内容阅读
乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一种危害严重的虫媒性人畜共患病。JEV主要是通过猪和蚊子进行传播,感染后主要引起母猪流产、死胎以及公猪的睾丸炎,不仅对养猪业造成很大的损失,同时也严重威胁人类的健康。本研究用原核表达的NS5蛋白和纯化的JEV分别免疫小鼠,经过细胞融合筛选到了6株特异性的JEVNS5蛋白单抗和5株E蛋白单抗,并对这些单抗的生物学特性进行了验证,具体研究内容如下：1. JEV NS5蛋白单克隆抗体的制备及其靶抗原表位的研究利用原核表达的JEV NS5蛋白免疫小鼠,通过细胞融合筛选到了6株特异性的单克隆抗体,分别为：1G6.1F12、2A5、3C4、3H7、3F10,亚型分别为IgG2b、 IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG2a和IgG2a,轻链均为Kappa链。经间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测,这6株单抗均具有较好的特异性。在此基础上,构建NS5真核分片段表达质粒pCMV-NS5(1-405),pCMV-NS5(406-905)并将之分别转染293T细胞,然后通过IFA检测发现,上述6株单抗有2株(1F12、3F10)的靶抗原表位位于NS5蛋白的甲基转移酶结构域,有4株(1G6、2A5、3C4、3H7)的靶抗原表位位于RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)结构域。进一步经过序列比对、分段表达以及合成多肽,鉴定出3C4株单抗的靶抗原表位是位于NS5蛋白的432位的精氨酸残基。2. JEV E蛋白单克隆抗体的筛选和中和活性的检测本研究用扩增的JEV SA14-14-2疫苗株免疫小鼠,通过细胞融合筛选到了5株E蛋白的特异性单克隆抗体,分别为：2A5、2H12、3H10、4B4、4E1,其亚型分别为IgG1、IgG2b、IgG2b、IgG2b和IgG2b,轻链均为Kappa链。经间接免疫荧光和Western blot分析,这5株单抗均能和JEV有特异性的反应,其中3H10和4B4能与JEV反应而不能与原核表达的E蛋白反应。中和活性检测表明,有4株表现出对JEV病毒的中和活性；而2H12株表现出了明显的抗体依赖性增强(ADE)作用。