目的：动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是严重威胁人类健康的常见疾病和多发病，它常导致一些致死性的心脑血管方面的疾病，例如脑梗塞、心肌梗死等。动脉粥样硬化在早期的病理学中被描述为一种终末期退行性疾病，它会导致动脉管腔的广泛性狭窄，其发生过程及其复杂，是由多种因素参与的慢性炎症过程。其中内皮细胞、血管平滑肌细胞和巨噬细胞与动脉粥样硬化斑块的形成有着密切的联系。血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC）的表型转化、增殖、迁移是动脉粥样硬化发病的关键因素。血管平滑肌细胞不同于其它的细胞，当它受到外界损伤时，细胞会降低其特异性伸缩蛋白的表达，进而能促进细胞的增生和迁移。同时，基质金属蛋白酶的合成也会相应的增加，此过程能促进血管损伤的修复，如果这种修复的过程出现了异常，就会导致如高血压、动脉粥样硬化和血管狭窄等血管性的疾病。血管平滑肌细胞表型的变化在血管性疾病形成的过程中起着十分重要的作用。平滑肌细胞的状态分为“合成型”和“伸缩型”，这两种状态呈现此消彼长的关系。当细胞呈现“合成型”状态时，其保持“伸缩型”状态的基因处于被抑制的状态，而与增殖迁移相关的一些基因则高表达。这种“合成型”状态的细胞能够分泌相关的基质金属蛋白酶和相关弹性蛋白，最终导致受损血管的修复和重塑。在动脉粥样硬化斑块形成、斑块破溃的过程中，伴随着平滑肌细胞的增生。热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是生物受到外界不良刺激发生反应而产生的应激蛋白，存在于原核和真核生物中，可被免疫系统视为外源分子，诱发自身免疫反应。这种蛋白在细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡等细胞活动中发挥着重要作用。迄今为止，已发现了二十多种HSP。它们多以分子量命名，如HSP10、HSP20、HSP27、HSP40、HSP60、HSP70等。一些研究显示HSP与动脉粥样硬化发生发展过程密切相关。如HSP27具有调节肌动蛋白活性、抗细胞凋亡、抗氧化应激、抗炎等作用。在动脉粥样硬化斑块中，能检测到HSP27基因的表达，由于HSP27与HSP20在结构上具有较高的同源性，因此，HSP20在平滑肌细胞中也能大量表达，对细胞的迁移、肌肉的收缩起到调节作用，进而参与动脉粥样硬化的形成。此外，在冠状动脉粥样硬化患者中，血清中也会检测到HSP70的表达。有研究显示，在兔动脉粥样硬化模型中，平滑肌细胞的增殖与HSP70基因表达呈正相关。随着内膜的增厚，HSP70基因表达水平明显增高。现有的流行病学、病理学和动物模型的研究资料表明，HSP60与AS的发生发展有密切关系。研究显示在人的动脉粥样硬化区域中的细胞内能检测到内源性HSP60，且病变的程度和HSP60的表达量成正相关。还有研究发现HSP60可作为一种促炎症性因子，在心脏病患者和不同程度的冠状动脉疾病患者的血清中都呈现不同的表达量。血清中HSP60表达水平越高，发生心血管疾病的可能性就越大。而且HSP60血清表达量越高，与患者病情的严重程度呈正相关。已有文献提示HSP-60致AS的发生可能主要有两方面原因：（1）生物受到各种外界刺激后血管壁产生大量的内源性HSP60，它作为一种自身抗原可以激发局部免疫反应，损伤血管内皮系统，促进AS的发生发展；（2）病原感染宿主后，针对病原体产生的外源抗原-抗体复合物沉积于血管壁，进而激活补体，调节T细胞的功能，诱导血管壁细胞产生细胞因子及粘附因子，促进AS进展。HSP60作为抗原被机体的免疫体通过免疫细胞表面的受体所识别，如TLR样受体（TLR-2或TLR-4）。许多研究报道TLR样受体是一种小分子的HSP受体。该类受体能激活NF-κB通路，进而释放一些促炎性因子。而TLR-4基因的突变和多态性与动脉粥样硬化的形成有着密切的关系。尽管许多研究显示HSP60与AS发生发展关系密切，然而关于HSP60与AS形成的分子机制的研究却鲜为报道。本研究拟通过HSP60对于大鼠主动脉血管平滑肌细胞(A7r5)增殖和迁移的作用及相关信号通路的研究，以求进一步探寻HSP60与AS形成的分子机制，为AS发病机制的研究开拓新的领域。方法：（1）在42℃条件下培养血管平滑机细胞（A7r5）1小时后，再经过37℃培养24h后提取胞浆蛋白，利用Western blot检测HSP60的表达量，并与正常37℃培养A7r5细胞提取的蛋白相比较，观察热刺激对内源性HSP60表达的影响；（2）Boyden Chamber法观察HSP60对细胞迁移的影响：①通过不同浓度HSP60（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml）分别刺激VSMC5h和24h，观察其是否能引起细胞的迁移，并确定最佳诱导细胞迁移浓度；②分别用10μmol/L、20μmol/L U0126（p-ERK抑制剂）预处理细胞1小时，再用10ng/mlHSP60刺激细胞24h，观察细胞的迁移是否收到抑制；③用TLR4抗体预封闭细胞表面受体1小时，再用10ng/mlHSP60刺激细胞24h，观察细胞迁移是否收到抑制；（3）划痕实验观察HSP60对细胞迁移的影响：用10ng/ml的HSP60刺激VSMC24h、48h后，在显微镜下观察细胞迁移的情况；（4）MTT方法观察细胞增殖变化：①检测不同浓度HSP60（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml）刺激A7r5细胞24h后，观察对细胞增殖的调节作用，确定最佳诱导细胞增殖的浓度；②分别用10μmol/L、20μmol/L U0126预处理细胞1小时，观察细胞的增殖是否收到抑制；③用TLR4抗体预封闭细胞表面受体1小时，再用10ng/mlHSP60刺激细胞24h，观察细胞增殖是否收到抑制；（5）利用10ng/ml HSP60刺激VSMC24h后收集细胞，流式细胞术检测细胞周期的变化；（6）不同浓度HSP60（1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml）在不同时间点（10min、30min、45min、1h、2h、4h）分别刺激VSMC后，利用Western blot检测p-ERK的表达量，观察HSP60诱导细胞增殖及迁移的信号通路；（7）利用Real Time PCR方法，检测HSP60诱导细胞增殖及迁移是否通过细胞表面受体TLR2或TLR4介导的；（8）用TLR4抗体对A7r5细胞预处理1小时，再经10ng/ml HSP60处理细胞24小时，通过Westernblot观察p-ERK的表达，验证HSP60诱导细胞增殖及迁移是通过TLR4受体介导的。结果：（1）经过42℃培养细胞1小时后，提取蛋白与正常37℃培养细胞内的蛋白比较，内源性HSP60表达明显增高；（2）Boyden Chamber结果显示：①不同浓度HSP60（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml）刺激VSMC后，均能诱导平滑肌细胞迁移，且细胞的迁移数量与浓度呈正相关。其中在10ng/ml的浓度，细胞的迁移量最多（P<0.05），因此将10ng/ml的浓度确定为最佳诱导浓度；②用10μmol/L及20μmol/L的U0126预处理细胞1小时后，细胞的迁移数量减少，其中20μmol/L的U0126预处理，细胞迁移数量明显减少，表明HSP60诱导VSMC迁移是与ERK信号途径有关；③TLR4抗体预封闭细胞表面受体1小时后，细胞迁移数量也明显减少，表明HSP60诱导VSMC迁移与TLR4受体相关；（3）划痕结果显示细胞在10ng/ml HSP-60刺激24h、48h后，细胞也有明显的迁移迹象，以48h最为明显；（4）MTT方法观察细胞增殖结果显示：①不同浓度HSP60（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml）刺激细胞后，在1ng/ml和5ng/ml HSP60是细胞增殖变化不明显，当10ng/ml、20ng/ml HSP60刺激时，细胞增殖数量明显增加（P<0.05），其中以10ng/ml HSP60处理细胞增殖更明显；②不同浓度10μmol/L、20μmol/L的U0126预处理细胞1小时后，细胞的增殖数量明显减少（P<0.05）；③用TLR4抗体预封闭细胞表面受体1小时，细胞增殖数量也明显减少（P <0.05）；（5）10ng/ml HSP60刺激细胞后，流式细胞术检测细胞周期中的S期明显升高；（6）不同浓度HSP60（1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml）刺激VSMC后，Western blot检测p-ERK的表达明显增加。其中在10ng/mlHSP60浓度时，p-ERK的表达量增加最多；不同时间点（10min、30min、1h、2h、4h）刺激VSMC后，p-ERK的表达量也呈增加的趋势，在10min时，p-ERK的表达量最多；（7）不同浓度HSP60（1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml）刺激VSMC后，Real Time PCR方法检测TLR-2和TLR-4受体在mRNA水平表达，结果显示HSP60能促进TLR-4受体表达，而不影响TLR-2受体表达。在10ng/mlHSP60刺激时，TLR-4的表达量最高；（8）用TLR4抗体封闭后，Western blot结果显示其p-ERK的表达量明显下降。结论：（1）血管平滑肌细胞（A7r5）在42℃条件下能够促进内源性HSP60表达；（2）HSP60能够诱导血管平滑肌的增殖及迁移，且与浓度、时间的变化呈正相关。其中在10ng/ml HSP60刺激下，细胞的增殖和迁移更明显；（3）HSP60促进血管平滑肌的增殖及迁移是通过增加MAPK信号通路ERK磷酸化有关；（4）HSP60调控血管平滑肌的增殖及迁移，是通过与细胞表面TLR-4受体作用,使胞内ERK磷酸化实现的。