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第一部分人PTB及RUNX3基因RNAi慢病毒载体的构建及验证目的构建人PTB和RUNX3基因RNA干扰(RNAi)的慢病毒载体并在工具细胞(人胚肾细胞HEK-293T)中验证表达效果。方法针对人PTB基因和RNX3基因分别设计两对RNAi序列,设计并合成其siRNA的DNA Oligo,经退火形成双链DNA后,运用T4噬菌体DNA连接酶与经BgⅢ和HindⅢ双酶切后的pSUPER连接,转化感受态细胞。使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增检测阳性菌落,小提质粒,经ClaI和EcoRI双酶切后通过琼脂糖凝胶电泳提取DNA并纯化,同时将ClaI和EcoRI双酶切后的pLVTHM双酶切后通过琼脂糖凝胶电泳提取DNA并纯化,运用T4噬菌体DNA连接酶连接,转化感受态细胞。使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增检测阳性菌落,挑选阳性克隆菌液进行测序分析。选择测序鉴定正确的克隆,抽提pLVTHM-PTB质粒,同时抽提包装质粒和信封质粒。用lipofectamine 2000将三种质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装,获得的病毒浓缩液采用逐孔稀释滴度测定法进行病毒生物学滴度测定。用构建的慢病毒载体感染HT-29,并设置阴性对照租。使用RT-PCR和western-blot方法检验两种慢病毒载体的干扰效率。结果重组质粒pLVTHM-PTB和pLVTHM-RNX3构建完成后,测序结果表明为正确序列,大提质粒用于包装慢病毒。通过逐孔稀释滴度测定法转染六孔板中的HEK293T细胞,共设3组,病毒转染组浓度分别为1μl/ml和2μl/ml,阴性对照组未转染病毒,转染后第三天在荧光显微镜下观察转染效率。结果表明pLVTHM-PTB和pLVTHM-RNX3两种慢病毒在2μl/ml浓度下转染效率最高。将两种慢病毒分别转染大肠癌HT29细胞,在转染第三天和第四天分别提取RNA和蛋白,并通过RT-PCR和western-blot检测基因抑制情况。结果表明PTB在第三天和第四天都有较好的抑制效率,并以第四天抑制率更高,RUNX3在第三天抑制效率不显著,在第四天较为明显。结论运用RNA干扰技术制备抑制大肠癌细胞PTB和RUNX3基因的活性的质粒,通过lipofectamine 2000成功制备相应慢病毒,并转染给HEK293T细胞和大肠癌细胞得到阳性细胞株,利用PCR和western-blot技术分析后表明有较高的转染效率。第二部分组氨酸去乙酰化酶,caspases,多聚嘧啶通道结合蛋白和RUNX3对大肠肿瘤的调节作用目的探讨在大肠肿瘤发生发展过程中引起大肠肿瘤凋亡的相关基因及信号传导通路。方法通过RT-PCR, western-blot分别检测相关基因在体内外的转录和翻译水平的表达,并使用real-time PCR进行定量分析。结果HT-29细胞分别转染不同浓度pLVTHM-PTB慢病毒后的第3、4天,分别提取细胞蛋白,通过western-blot结果检测RUNX3的表达在翻译水平呈上升趋势。HT-29细胞分别转染不同浓度pLVTHM-RUNX3慢病毒后的第3、4天,分别提取细胞蛋白,通过western-blot结果检测PTB的表达在翻译水平呈上升趋势。HT-29细胞成功转染pLVTHM-PTB慢病毒后的第3、4、5、6天,分别提取细胞蛋白,通过western-blot结果检测HDAC 1,2,5的表达在翻译水平呈下降趋势。在HT-29细胞中加入组氨酸去乙酰化酶抑制剂:HDACi)后PTB的断裂增加,此过程是由caspase依赖的外部信号通路激活所引起。结论RUNX3和PTB在大肠肿瘤细胞中互为反向调节关系；HDAC与PTB在大肠在肿瘤中的表达呈正相关；在大肠肿瘤的调节过程中,caspase依赖的外部信号通路参与了由于HDAC缺失所导致的PTB蛋白断裂。