棉铃虫谷胱甘肽S-转移酶的诱导表达及其基因克隆

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本论文以棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)为对象,对谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)反应的最适条件、植物次生物质和杀虫药剂对GSTs的体外抑制作用、GSTs在棉铃虫不同组织器官中的表达差异、植物次生物质对GSTs诱导表达进行了研究。并对GSTs进行了部分纯化及同功酶分析,对GSTs基因进行了克隆和序列分析。 棉铃虫中肠GSTs的最适pH值为7.5~9,而脂肪体为9;中肠GSTs的最适反应温度为50℃,而脂肪体GSTs为45℃;酶含量过大(总蛋白含量>60μg/ml)对GSTs酶促反应有一定程度的抑制作用;谷胱甘肽(GSH)和1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)浓度过高(GSH>8mM,CDNB>2mM)对酶促反应具有抑制作用。 单宁酸、槲皮素和芸香苷三种植物次生物质对棉铃虫GSTs的CDNB轭合活性具有很强的抑制作用,但单宁酸与CDNB为竞争性抑制,槲皮素为非竞争性抑制,而芸香苷为混合性抑制。在0.1 mM的浓度下,有机磷和氨基甲酸酯类药剂对棉铃虫GSTs的抑制率在20-35%之间,而拟除虫菊酯则几乎没有抑制作用。抑制率随抑制剂浓度的增加而增大。 棉铃虫GSTs在不同组织的表达差异很大。中肠、脂肪体、头部和体壁的酶比活力分别为554.9、412.6、286.6和150.5nmol/mg pro./min。与室内敏感种群相比,田间种群中中肠GSTs的比活力增加了66%,但脂肪体GSTs活性没有显著差异。棉铃虫不同组织、不同种群的GSTs对CDNB和GSH的亲和力都没有显著差别。 用2-十三烷酮、槲皮素和单宁酸诱导48h后,棉铃虫中肠GSTs的比活力都有不同程度增加,而脂肪体GSTs的比活力都有所降低;它们与底物的亲和力都没有明显改变,内源性GSH的含量也没有明显变化。表明三种植物次生物质对棉铃虫GSTs的诱导主要是引起GSTs的表达量改变,可能没有引起同功酶组成的变化。 从1龄初孵幼虫开始用0.005%的单宁酸处理棉铃虫幼虫,对5龄和6龄幼虫GSTs的活性有明显的抑制作用,比活力分别为对照的0.59和0.67倍。低剂量、短时间处理,可诱导棉铃虫幼虫中肠和脂肪体中GSTs的活性增加,高剂量或低剂量长时间处理没有诱导增加作用,甚至还有抑制作用。单宁酸连续处理4代,对中肠GSTs均表现抑制作用,对脂肪体GSTs无显著影响或有抑制作用。 用GSH-Sepharose 4B亲和层析柱一步法纯化,获得了纯度较高的GSTs,SDS-PAGE和PAGE结果显示,棉铃虫中肠含有3个GST同功酶,而脂肪体则有5个同功酶,它们亚基的分子量相同或相似,约30kD。单宁酸处理对棉铃虫GST的同功酶组成没有影响。 根据鳞翅目昆虫中已发表的Ⅰ类和Ⅲ类GST基因的保守序列设计一对引物,用RT-PCR方法从棉铃虫中肠和脂肪体中分别克隆出219bp的GST基因片段,然后用3’-RACE的方法克隆出3’端全长序列。共获得3条743bp的GST基因片段,编码198个氨基酸。系统分析的结果表明,这三条基因片段均属于昆虫Ⅲ(Epsilon)类GST基因。
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