目的:受精卵早期分裂及发育过程中微丝骨架(microf ilament cytoskeleton)对精卵融合、纺锤体旋转、分裂沟形成及胞质分裂的完成有着十分重要的作用。多项研究表明微丝骨架的形成受多种因子调控。在哺乳动物尤其在小鼠受精卵细胞的分裂及早期发育过程中,微丝骨架形成和变化的调控因子及信号调控机制尚不清楚。研究发现由mTOR(mammalian target of rapamycin)组成的mTOR/Rictor(mTORC2)复合物,即雷帕霉素不敏感复合体,与微丝骨架的建立有很大的相关性。但是mTORC2通过什么机制介导微丝骨架的聚集仍是未知。研究报道mTORC2可经Rho家族GTPases改变细胞骨架的形成。也有报道通过PKC的介导,经Rho A/ROCK的路径影响Myo I。而在中性粒细胞趋化运动中,mTORC2可以独立地调节纤维型肌动蛋白(F-actin)极化。更有一些科学家猜测mTORC2通过磷酸化Akt和PKC,把信号传递给小GTPases(Rho A、Rac1),从而实现控制肌动蛋白的组建。基于上述调控途径的诸多不明确性,mTORC2对微丝骨架聚集的信号调控途径成为研究者们追随的研究热点。而关于mTORC2在小鼠受精卵早期发育中对微丝骨架聚集及定位所发挥的作用,国内、外文献更鲜有报道。我们的前期研究发现,敲低RICTOR的表达能够影响小鼠受精卵早期的分裂。我们分析mTORC2在小鼠受精卵中的作用是参与了微丝骨架分布的调控。虽然介导微丝骨架聚集的mTORC2直接作用的靶分子还不清楚,近期涌现的研究结果显示mTORC2复合物可磷酸化Akt的Ser473位点,mTORC2能够正调控Akt蛋白。这不禁让人猜想mTORC2是经由Akt的磷酸化实现对微丝聚集的调控功能。蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与v-akt基因编码的Akt蛋白同源,又被称为Akt。Akt主要通过PI3K途径调节细胞多种生理功能,并被确定为参与肿瘤侵袭和转移的重要信号途径。研究报道敲低Akt表达能够抑制神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。Franck Vandermoere等人的研究发现Akt参与乳腺癌细胞迁移同微丝骨架的重新构建密切相关。有关Akt能否影响小鼠受精卵微丝骨架的分布,相关报道甚少。我们的前期研究发现Akt(PKB)在小鼠卵母细胞及早期受精卵中存在且能够促进受精卵的分裂。我们分析Akt可影响小鼠受精卵细胞微丝骨架的正确聚集及分布。虽有研究报道敲除Akt不影响小鼠胚胎的正常发育,我们分析认为这种情况可能是因为Akt在细胞内敲低后可被其它途径代偿。并且虽Akt敲低不影响胚胎正常发育,但是不排除异常胚胎、多倍体胚胎及多胞胎的出现。由于mTORC2最为人熟知的是他特异性地磷酸化Akt的Ser473位点并将其激活。据此我们推测mTORC2可能通过磷酸化Akt的Ser473位点改变小鼠受精卵微丝骨架的聚集。由于Akt与mTORC2密切相关性,它仍然有直接或间接地在一些细胞中通过其他一些途径实现对细胞骨架控制的可能。因有关mTORC2-Akt对微丝骨架的具体调节机制还未有定论,仍需要大量的实验阐述。Girdin(girders of actin filaments)是一个新近发现参与微丝交联的Akt底物蛋白,也被称为APE(Akt phosphorylation enhancer)、GIV(Gα-interacting vesicle associated protein)。其在多种类型癌细胞及未成熟的血管内皮细胞中表达,参与多种细胞进程,包括重新构建微丝骨架、内吞作用,最终导致癌症的侵袭和血管的再生。Girdin蛋白最早是通过酵母双杂交方法作为Akt连接蛋白而被发现的。研究显示在多种类型的生长因子刺激下,Akt能够磷酸化Girdin蛋白C-末端区域的ser-1416位点,使其在细胞迁移过程中细胞骨架的重构扮演重要角色。Girdin蛋白仅同Akt的C末端连接但是不能同其他AGC家族成员包括蛋白激酶C和SGKs相结合。表明Girdin仅参与了Akt信号途径。然而,关于Girdin蛋白在小鼠受精卵早期分裂中对微丝分布的作用及同Akt的相互关系,国内、外文献却未见报道。我们根据Scansite软件(http://scansite.mit.edu)预测了Akt和鼠Girdin蛋白的相关位点。结果发现鼠在1417位有一个丝氨酸残基而这一位点恰恰和人Girdin蛋白丝氨酸1416位点相一致。结合Girdin蛋白在小鼠受精卵中的研究空白及其在其在肿瘤细胞中的作用,进而提出假设:即Akt通过磷酸化Girdin蛋白参与调节小鼠受精卵早期发育微丝骨架的形成和分布,从而调节小鼠受精卵早期的发育。我们大胆推测Akt蛋白能够使Girdin蛋白磷酸化,磷酸化的Girdin蛋白从质膜上分离,牵引着微丝聚集在受精卵分裂处,参与形成溢缩环,并且磷酸化的Girdin蛋白同Akt结合促进Akt锚定于细胞质膜上,进而维持Akt蛋白高催化活性,促进受精卵的分裂。但是具体机制需要相应实验验证进行说明。因此,我们认为十分有必要对Girdin蛋白在小鼠受精卵微丝骨架的形成和变化中的作用及同Akt的关系进行更深一步的研究。综上所述,Akt为mTORC2的下游效应分子,而Girdin蛋白又为Akt的作用底物。如果能够证明在小鼠受精卵早期发育中mTORC2通过Akt影响微丝骨架的分布,而Akt又可通过Girdin蛋白发挥作用,再能证明mTORC2直接或间接改变Girdin蛋白的磷酸化,那么我们分析,在小鼠受精卵早期发育中,mTORC2通过Akt依赖的Girdin途径导致微丝骨架分布的改变,促进受精卵早期的发育。结合上述文献研究我们认为小鼠受精卵早期细胞分裂中微丝骨架的聚集与分布受到mTORC2/Akt/Girdin信号途径的调节并将对这一途径进行实验证明。这将为明确受精卵早期细胞的正常分裂、发育机理提供理论依据。并也对在小鼠受精卵发育早期中出现的异常胚胎现象提供一定的理论基础。方法:1、小鼠超排卵及受精卵的采集和培养2、体外转录3、显微注射与形态观察4、Western印迹法检测蛋白表达5、微丝的免疫荧光化学检测6、激光共聚焦显微镜成像分析7、数据处理结果:1、激光共聚焦显微镜观察小鼠卵母细胞及早期胚胎中发育中F-actin的分布规律采用免疫荧光技术,激光扫描共聚焦显微镜下观察并分析小鼠卵母细胞M2期、1-细胞期及2-细胞期受精卵中微丝的分布特点。结果显示F-actin在卵母细胞中靠近细胞膜下的皮层处分布。小鼠1-细胞期受精卵中分布在皮质区但更集中定位在和极体相连处。而在2-细胞胚胎中,微丝除分布于皮质区外还集中分布在卵裂球沟,参与构成缢缩环。此部分结果初步说明微丝参与了受精卵早期发育的多个过程。2、mTORC2通过改变微丝骨架构建影响小鼠受精卵早期分裂利用sh RNA沉默raptor或rictor基因的表达,观察受精卵分裂及微丝聚集改变情况。相差显微镜对发育情况进行观察发现经rictor sh RNA注射处理的小鼠受精卵发育受到阻滞,而raptor sh RNA注射组和对照组受精卵则都能顺利进入二细胞期。接下来用罗丹明标记的鬼笔环肽(TRITC-phalloidin)标记受精卵中的F-actin。激光共聚集观测结果显示同对照组相比较在rictor表达敲低的受精卵中微丝出现异常的形态,荧光信号散在分布并且在二细胞中微丝不能正确聚集在分裂沟处。观察结果说明在小鼠受精卵发育早期rictor表达敲低能够影响微丝的正确聚集。3、Akt表达及活性改变对小鼠受精卵分裂及微丝聚集状态的影响采用0.03ng编码的Akt-WT mRNA、myr-Akt mRNA、KD-Akt mRNA的及10μMAkt siRNA对小鼠一细胞期受精卵进行处理。相差显微镜观察结果显示在注射激活型Akt mRNA后小鼠受精卵的分裂率明显高于对照组,而激酶失活型及siRNA注射组小鼠受精卵的分裂率显著低于对照组。提示Akt表达及活性增强促进小鼠受精卵分裂,相反敲低Akt的表达或降低Akt的活性则抑制了小鼠受精卵的分裂。激光共聚焦显微镜观察微丝状态显示小鼠受精卵在注射野生型及持续激活型Akt的mRNA后在2-细胞的分裂沟处荧光信号明显增强,而注射Akt siRNA的受精卵的微丝不能形成正确聚集状态,细胞出现不规则分裂。4、mTORC2通过磷酸化Akt影响小鼠受精卵早期微丝的聚集采用Western blotting的方法检测经raptor/rictor敲低处理后的小鼠受精卵细胞中Akt蛋白的磷酸化情况。结果显示在对照组和注射raptor sh RNA组的小鼠受精卵中Akt蛋白在473位点磷酸化状态都显著高于rictor sh RNA处理组。说明敲低mTORC2阻止小鼠受精卵中内源性Akt蛋白的磷酸化。接下来采取rictor sh RNA和WT-Akt mRNA共注射分析小鼠受精卵微丝聚集改变情况。激光共聚焦荧光显微镜观察结果显示在单独rictor sh RNA注射组小鼠受精卵中的微丝呈弥散分布,细胞出现不对称性或不规则分裂形态。单独注射WT-Akt mRNA组小鼠受精卵中微丝荧光信号增强且集中分布在二细胞期的分裂沟处。而rictor sh RNA和myr-Akt mRNA共注射组小鼠受精卵中的微丝荧光信号减弱并成类似于单独rictor sh RNA注射组微丝分布情况。结果说明mTOR/Rictor是通过作用于小鼠受精卵内的Akt蛋白影响受精卵微丝的聚集。Akt蛋白为mTOR/Rictor的下游作用蛋白发挥作用。5、Girdin表达敲低对小鼠受精卵第一次有丝分裂及微丝状态的影响利用RNA干扰敲低小鼠受精卵中Gridin蛋白的表达。在hCG35小时通过相差显微镜对Girdin siRNA处理组和对照组进行卵裂形态观察和分裂率统计。统计结果显示同对照组相比经Girdin siRNA处理小鼠受精卵分裂率明显降低。用Girdin抗体进行免疫荧光染色显示在Girdin siRNA注射的受精卵细胞中Girdin的表达非常低。用鬼笔环肽标记F-actin显示在Gridin siRNA处理的小鼠受精卵F-actin不能正确聚集在分裂沟处,细胞呈现不对称分裂或异常分裂形态。6、Akt同Girdin蛋白的作用关系及小鼠受精卵中Akt及Girdin蛋白对微丝聚集的调控根据Scansite软件(http://scansite.mit.edu)预测了Akt和鼠Girdin蛋白的相关位点。我们发现鼠在1417位有一个丝氨酸残基而这一位点恰恰和人Girdin蛋白丝氨酸1416位点相一致。通过取小鼠G1期受精卵显微注射野生型和持续激活型Akt的mRNA或利用siRNA沉默Akt蛋白编码基因,免疫印迹检测Girdin的1417位磷酸化及Girdin蛋白的总表达情况。结果显示野生型和持续激活型Akt的mRNA注射组Girdin的ser1417位磷酸化增强但是并不影响Girdin蛋白的总的表达。siRNA介导的Akt表达敲除非常明显的降低了Girdin的磷酸化水平。然而,敲除Girdin蛋白并不能影响Akt的磷酸化。上述结果说明在小鼠受精卵中Akt可磷酸化Girdin蛋白的Ser1417位。接下来通过激光共聚焦显微镜观察经持续激活型Akt mRNA、野生型Akt mRNA、激酶失活型Akt mRNA及Akt siRNA处理后小鼠受精卵中Girdin1417及F-actin的定位状态。结果显示对照组中Girdin1417弥散分布在胞浆中,而经持续激活型Akt mRNA、野生型Akt mRNA处理后的小鼠受精卵中FITC标记的Girdin-1417荧光信号较对照组及Akt siRNA处理组明显增强,并且观察发现微丝的荧光信号在分裂沟处增强,分布位置也更加集中在2-细胞期小鼠受精卵的分裂沟处,这也说明磷酸化的Girdin蛋白可能参与了微丝的正确聚集。接下来先用Akt-WT mRNA或myr-Akt mRNA处理小鼠G1期受精卵培养2小时后再进行Girdin siRNA注射处理。通过激光共聚集荧光显微镜观察每一组卵细胞的F-actin聚集状态。在Akt mRNA和Girdin siRNA共注射组F-actin荧光信号出现了明显的下降,微丝正确聚集收到干扰。这同单独注射Girdin siRNA组出现的结果相一致。说明Akt可能通过作用Girdin蛋白影响微丝聚集。7、mTORC2影响Girdin蛋白的磷酸化采用Western blotting方法检测经raptor/rictor敲低处理后的小鼠受精卵细胞中Girdin蛋白1417位点的磷酸化情况。结果显示在对照组的小鼠受精卵中Girdin蛋白在1417位点是呈磷酸化状态。而rictor sh RNA处理组检测不到Gridin蛋白的磷酸化。注射raptor sh RNA组Girdin的磷酸化状态同对照组相似。因此我们认为敲低mTORC2阻止了Girdin蛋白的磷酸化。8、mTORC2通过作用Akt蛋白影响Girdin蛋白的磷酸化为明确Akt在mTORC2影响Girdin蛋白磷酸化中的作用,实验中取小鼠G1期受精卵先显微注射rictor sh RNA或raptor sh RNA然后移入M16中培养2小时后再显微注射myr-Akt mRNA培养20小时后,收集受精卵细胞用免疫印迹法检测Girdin蛋白的磷酸化。蛋白免疫结果显示同对照组及单独注射rictor sh RNA组相比较rictor sh RNA和myr-Akt mRNA共注射组的Girdin蛋白磷酸化明显降低。而单独注射myr-Akt mRNA组Girdin蛋白的磷酸化是增强的。结果说明Akt参与了mTORC2对Girdin蛋白的磷酸化调节。结论:1、mTORC2、Akt、Girdin通过改变微丝的聚集影响小鼠受精卵早期分裂。2、Akt通过磷酸化Girdin蛋白的1417位,影响小鼠受精卵微丝的聚集。3、mTORC2通过磷酸化Akt影响Girdin蛋白的磷酸化,改变小鼠受精卵微丝的聚集。