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对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是含有囊膜的无包涵体杆状双链DNA病毒,属于线形病毒科(Nimaviridae)白斑病毒属(Whispovirus)。WSSV传染能力强,致死率高,是养殖虾类的主要病害之一,感染后可导致养殖对虾大规模死亡。到目前为止,WSSV侵入虾类细胞的路径还没有得到确切的阐述。 红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)又名“澳洲淡水龙虾”,是世界名贵淡水经济虾种之一。研究结果表明白斑综合征病毒对淡水螯虾同样有致病性,感染过程类似,淡水螯虾的造血组织(Hematopoietic tissue,Hpt)干细胞易被WSSV侵染,是一种理想的研究WSSV感染的细胞模型。本文以红螯螯虾Hpt为模型,利用蛋白pulldown技术研究了与WSSV囊膜蛋白相互作用的红螯螯虾Hpt蛋白,并进一步研究了细胞膜胆固醇、细胞骨架和内吞关键蛋白dynamin在WSSV入侵红螯螯虾Hpt细胞过程中的作用。取得如下成果: 1.利用pulldown技术研究了与WSSV囊膜蛋白相互作用的红螯螯虾Hpt蛋白。通过SDS-PAGE分离、银染以及质谱鉴定,获得14个蛋白:tubulin、actin、线粒体ATP合成酶α亚基前体、谷氨酰胺转移酶、血蓝蛋白2、二硫键异构酶、GAPDH、Hsp90、Hsp70以及Hsp60等。 2.利用MβCD消除细胞膜胆固醇,病毒入胞被抑制,再添加外源胆固醇使细胞膜胆固醇含量恢复,病毒入胞得到恢复;利用细胞松弛素B解聚细胞F-actin,病毒入胞受到抑制。上述结果表明胆固醇和细胞骨架actin在病毒感染的过程中发挥重要作用。 3.利用RACE技术克隆获得红螯螯虾发动蛋白Cq-dynamin cDNA全长和Cq-dynamin-1的开放阅读编码框(ORF)。利用RNA干扰技术敲降Cq-dynamin和Cq-dynamin-1基因表达,发现WSSV入胞被显著抑制,表明dynamin在WSSV入胞过程中具有重要作用。 综上,本论文鉴定了与WSSV囊膜蛋白相互作用的红螯螯虾Hpt蛋白,并发现细胞膜胆固醇、细胞骨架actin和dynamin在WSSV入侵红螯螯虾Hpt细胞过程中发挥重要作用。