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铁皮石斛Dendrobium officinale Kimuraet Migo是珍稀的石斛属药用植物之一,具有益胃生津、滋阴清热等功效。生物碱是铁皮石斛主要药用成分之一,其生物碱大多属于倍半萜类生物碱或萜类吲哚生物碱,两类生物碱生物合成均起源于萜类途径(MVA、MEP途径)。1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是MEP途径中的关键酶,然而铁皮石斛DXS、DXR、HDR信息及其相关功能至今未见报道。本论文主要克隆了铁皮石斛DXS、DXR、HDR的cDNA全长并进行功能分析,旨在研究DXS、DXR、HDR在铁皮石斛生物碱合成途径中的作用。主要结果如下:(1)采用RT-PCR和RACE等方法克隆得到铁皮石斛DoDXS、DoDXR、DoHDR全长(GenBank登录号分别为KF803334、KF412827、KC344827)。(2)组织特异性表达分析表明,DoDXS、DoDXR、DoHDR在铁皮石斛各个组织中都有表达;其中DoDXS在原球茎中表达量最高,是叶的3.86倍;DoDXR在茎中表达量最高,是原球茎的2.26倍;DoHDR在叶中表达量最高,是原球茎的2.72倍。(3)通过茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,DoDXS的表达量在12 h显著升高,48 h达到高峰,上升5.17倍,之后下调;但DoDXR、DoHDR却不受MeJA诱导。水杨酸(SA)处理4 h后,DoDXS、DoDXR、DoHDR表达量均显著升高,最高值分别为对照的5.46、5.25、3.36倍。脱落酸(ABA)均诱导DoDXS、DoDXR、DoHDR的表达量上升,峰值分别为对照的2.82、4.49、6.37倍。油菜素内酯(BR)均诱导DoDXS、DoDXR、DoHDR的表达,24 h达到峰值,分别为对照的1.59、2.27、1.26倍。(4)成功构建真核表达载体pCambia1301-DoDXS、pCambia1301-DoDXR、pCambia1301-DoHDR。亚细胞定位分析表明DoDXS、DoDXR、DoHDR均定位于叶绿体上。通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥,获得DoDXS-T2代转基因植株9个株系,且DoDXS都获得超表达;获得DoDXR-T1代拟南芥转基因植株DoDXR-T1代30株。(5)利用MVA和MEP途抑制剂——洛伐他汀和膦胺霉素,研究铁皮石斛生物碱的生物合成途径;试验结果表明,洛伐他汀对铁皮总石斛生物碱生物合成的抑制率为26.27%,膦胺霉素对铁皮总石斛生物碱生物合成的抑制率为33.62%;并推测MEP途径在铁皮石斛生物碱的生物合成中占主要作用。通过酶活性检测,发现MVA、MEP两个不同的萜类代谢途径,有明显的交互调节机制。